丁酰胆碱酯酶(BchE)活性检测试剂盒 ; 100T/96S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体125mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体12mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
产品说明：
丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase，BchE， EC3.1.1.8) ，又称血浆胆碱酯酶 ，假性胆碱酯酶 ，是一种丝氨酸水解酶 ， 由肝脏合成后进入血液 ，几乎存在于所有动物组织中。 BchE结构与乙酰胆碱酯酶(AchE)相似，但底物特异性和抑制剂敏感性不同。与 AchE 相比，BchE能够有效水解较大的胆碱酯，如丁酰胆碱和苯甲酰胆碱，而且可以清除有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药等神经毒剂的毒害作用。有研究表明 ， BchE 可作为阿尔茨海默病治疗的重要靶点。 BchE 催化丁酰胆碱水解生成胆碱 ，胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸(TNB)；TNB 在 412nm 处有吸收峰，通过测定 412nm 吸光度增加速率，计算 BchE 活性。
注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、低温离心机、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、丙酮(AR)、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、组织样本：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL) =1：5~10 比例加入试剂一(建议称取 0.1g样本 ，加入 1.0mL 试剂一) ，冰浴匀浆后 ，于 4℃,12000rpm 离心 10min ，弃沉淀 ，取上清液置于冰上待测。
2、血清/血浆等液体样本 ：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。
3、 细菌、细胞 ：按照细胞数量 10⁴个 ：试剂一体积(mL)500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min)，于 4℃,12000rpm 离心 10min ，弃沉淀 ，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至412nm。分光光度计蒸馏水调零。
2、操作表: (在微量玻璃比色皿/96 孔板中加入下列试剂)
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
样本 | 10 | - |
蒸馏水 | - | 10 |
试剂二 | 100 | 100 |
试剂三 | 100 | 100 |
立即充分混匀后于 412nm 处测定 10s 时的吸光值 A1 ，迅速置于 37℃水浴或恒温培养箱 5min（酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃),拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2。计算ΔA 测定 =A 测定 测定 1，ΔA =ΔA 测定-ΔA 空白。空白管只需测定 1-2 次1 ，ΔA =ΔA 测定-ΔA 空白。空白管只需测定 1-2 次。 |
三、BchE活性计算
A、用微量玻璃比色皿测定：
1、按照蛋白浓度计算
活性单位定义：
每 mg 蛋白每分钟催化产生1nmolTNB 为1个酶活单位 。
BchE 活性(U/mgprot) =[ΔA÷(ε×d) ×V 反总 × 10⁹]÷ (Cpr×V 样)÷T × F =308.8 ×ΔA÷Cpr×F。
2、按照样本质量计算
活性单位定义：
每 g 组织每分钟催化产生 1nmolTNB 为 1 个酶活单位。
BchE 活性(U/g质量) =[ΔA÷(ε×d) ×V 反总× 10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T× F =308.8×ΔA÷W×F。
3、按照液体体积计算
活性单位定义 ：
每 mL 血清/血浆每分钟催化产生 1nmolTNB 为 1 个酶活单位。
BchE 活性(U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总 × 10⁹]÷V 样÷T ×F =308.8×ΔA× F。
4、按细菌/细胞数量计算
活性单位定义：
每万个细胞每分钟催化产生 1nmolTNB 为1个酶活单位。
BchE 活性(U/10⁴cell) =[ΔA÷(ε×d) ×V反总× 10⁹]÷ (N×V样÷V样总)÷T×F =308.8×ΔA÷N×Fε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.21mL=2.1×10⁴L；10⁹：单位换算系数，1mol =1×10⁹nmol；V 样：反应体系加入样本体 积,0.01mL；V 样总：加入试剂一体积,1mL；Cpr：蛋白浓度,mg/mL；W：样本质量,g；T：反应时间,5min；F：样本稀释倍数；N：细菌/细胞数 量，以万计。
B、用 96 孔板测定：
将上述公式中的 d- 1cm 改为 d-0.6cm 进行计算即可。
注意事项：
1、为保证结果准确，请严格控制反应时间，建议两人进行实验，一人加样，一人计时
2、 如果∆A 测定接近∆A 空白，可以增加样本量后再进行测定； 如果 A2 测定大于 1 或ΔA测定大于0.7，建议将样本上清用试剂一适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。
实验实例：
1、取 0.1018g 大鼠肝脏样本，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，离心后上清液用试剂一稀释2倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定2-A测定1 =0.636-0.417 =0.219，ΔA空白=A空白2-A空白1 =0.188-0.180 =0.008，ΔA =ΔA 测定-ΔA空白=0.211，按样本质量计算得(光径为0.6cm带入计算)：BchE 活性(U/g 质量) =[Δ A÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷ (W×V样÷V样总)÷T×F =2133.49U/g质量。
2、取人血清样本，用试剂一稀释16倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定2-A测定1 =0.960-0.299 =0.661，ΔA空白=A空白2-A空白1 =0.188-0.180 =0.008，ΔA=ΔA测定-ΔA 空白 =0.653，按液体体积计算得(光径为 0.6cm带入计算)： BchE 活性(U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总 × 10⁹]÷V 样÷T × F =5377.237U/mL。
