谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒 ; 50T/48S

谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒 ; 50T/48S

测定意义： 

GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中 ，和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的调控。GOGAT 以 NADH 为电子供体，催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸，NADH 在 340nm吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。

试剂盒组成和配制：

溶液的配制：

工作液的配制 ：取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入 30mL 试剂一中溶解 ，现用现配，可分装后-20℃保存 ，避免反复冻融。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量）

1、细菌或培养细胞 ：先收集细菌或细胞到离心管内 ，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个) ：提取液体积(mL)为 500~1000： 1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液) ，超声波破碎细菌或细胞(冰浴 ，功率 20%或 200W ，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次)； 10000g4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。

2、组织 ：按照组织质量(g) ：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液) ，进行冰浴匀浆。 10000g4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计预热 30min 以上 ，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。

2、工作液提前配置 ，平衡至室温。

3、样本测定

三、GOGAT活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算：

      单位的定义 ：

      每mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

      GOGAT(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T =321.5×ΔA÷Cpr

(2) 按样本质量计算：

      单位的定义：

      每g组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

      GOGAT(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=321.5×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞数量计算：

      单位的定义： 

      每1万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

      GOGAT(U/10⁴cell) =[ΔA×V 反总÷ (ε×d)× 10⁹]÷ (500 ×V 样÷V 样总)÷T =0.643 ×ΔAV 反总：反应体系总积,10―³L；ε ：NADH 摩尔消光          系数,6.22 × 10³L/mol/cm；d：比色皿光径 ,1cm；V,样,：加入样本体积 ，0.1mL；V 样总 ：加入提取液体积 , 1mL；T：反应时间 ,5min;              Cpr：样本蛋白质浓度,mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数,500万; 10⁹：单位换算系数, 1mol =10⁹nmol。

注意事项：

1、测定期间样本在冰上放置 ，以免变性和失活。

2、两个人同时做此实验 ，一个人比色 ，一个人计时 ，以保证实验结果的准确性。

3、当 A1 大于 1.5 或者ΔA 大于 0.6 时 ，建议将样本用蒸馏水稀释后测定 ，当ΔA 过小时，可以延长酶促反应时间(10min 或 15min)或者加大加入的样本体积进行测量。

4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL) ，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1、取 0.1g 红豆芽加入 1mL 提取液进行匀浆研磨 ，取上清后按照测定步骤操作 ，测得计算ΔA =A1-A2 =1.23-1.067 =0.163 ，按样本质量计算酶活得： GOGAT(U/g 质量) =321.5 ×ΔA÷W =321.5 ×0.163÷0.1 =524U/g 质量。

2、取 0.1g 稗草加入 1mL 提取液进行匀浆研磨 ，取上清后按照测定步骤操作 ，测得计算Δ A =A1-A2 =1.416-1.404 =0.012，按样本质量计算酶活得：GOGAT(U/g 质量) =321.5 ×ΔA ÷W =321.5 ×0.012÷0.1 =38.58U/g质量。