谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒 ; 100T/96S
测定意义：
GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中 ，和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的调控。GOGAT 以 NADH 为电子供体，催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸，NADH 在 340nm吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体100 mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
工作液的配制 ：取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入 10mL 试剂一中溶解 ，现用现配，可分装后-20℃保存 ，避免反复冻融。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品 ：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、细菌或培养细胞 ：先收集细菌或细胞到离心管内 ，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个) ：提取液体积(mL)为 500~1000： 1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液) ，超声波破碎细菌或细胞(冰浴 ，功率 20%或 200W ，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次)； 10000g4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。
2、组织 ：按照组织质量(g) ：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液) ，进行冰浴匀浆。 10000g4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至340nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、工作液提前配置,平衡至室温。
3、样本测定
试剂名称(μL) | 测定管 |
工作液 | 180 |
样本 | 20 |
在微量石英比色皿或者 96 孔 UV 板中混匀 ，加样本的同时开始计时 ，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 ，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 25℃水浴或培养箱中准确反应 5 分钟(若酶标仪带有控温功能 ，将温度调至 25℃);迅速取出比色皿并擦干 ，340nm 下比色 ，记录 5 分20 秒时的吸光度 A2 ，计算ΔA =A1-A2。 |
三、高铁螯合物还原酶(FCR)活性计算
(1) 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义 ：
每mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT(U/mgprot) =[ΔA ×V 反总÷ (ε×d) × 10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T =321.5 ×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算：
单位的定义 ：
每 g 组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT(U/g质量) =[ΔA×V 反总÷ (ε×d)× 10⁹]÷ (W ×V 样÷V 样总)÷T =321.5 ×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算 ：
单位的定义 ：
每1万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT(U/10⁴cell) =[ΔA×V 反总÷ (ε×d)× 10⁹]÷ (500 ×V 样÷V 样总)÷T =0.643 ×ΔAV反总：反应体系总体积,2 × 10―⁴L；ε： NADH 摩尔 消光系数 ，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径,1cm；V样：加入样本体积,0.02mL;V样总：加入提取液体积 ,1mL；T：反应时间,5min；Cpr： 样本蛋白质浓度,mg/mL;W：样本质量,g;500：细菌或细胞总数,500万;10⁹ ：单位换算系数,1mol =10⁹nmol。
2、按 96 孔 UV板计算：
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 孔 UV 板光径)进行计算即可。
注意事项：
1、测定期间样本在冰上放置,以免变性和失活。
2、两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时 ，以保证实验结果的准确性。
3、当 A1 大于 1.5 或者ΔA 大于 0.6(酶标仪ΔA 大于 0.4)时 ，建议将样本用蒸馏水稀释后测定，当ΔA 过小时，可以延长酶促反应时间(10min 或 15min)或者加大加入的样本体积进行测量。
4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL) ，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例：
1、取0.1g 红豆芽加入 1mL 提取液进行匀浆研磨 ，取上清后按照测定步骤操作 ，用微量石英 比 色 皿 测 得 计 算 Δ A =A1-A2 =1.3015-1.0895 =0.212，按样 本 质 量 计 算 酶 活 得 ： GOGAT(U/g 质量) =321.5 ×ΔA÷W =321.5 ×0.212÷0.1 =681.58U/g 质量。
2、取 0.1g 吊兰加入1mL 提取液进行匀浆研磨 ，取上清后按照测定步骤操作 ，用微量石英比 色 皿 测 得 计 算 Δ A =A1-A2 =0.9753-0.966 =0.0093 ，按样本质量计 算酶活得：GOGAT(U/g 质量) =321.5 ×ΔA÷W =321.5 ×0.0093÷0.1 =29.9U/g 质量。
