谷氨酰胺(Gln)含量检测试剂盒 ; 50T/24S

谷氨酰胺(Gln)含量检测试剂盒 ; 50T/24S

试剂盒组成和配制：

溶液的配制：

1、提取液二 ：氯仿 ，需自备。

2、试剂二：试剂质量很小，有可能肉眼观察不到，直接使用即可。临用前取一支加入 0.2mL蒸馏水 ， -20℃分装可保存 4 周 ，避免反复冻融。

3、试剂二工作液：提供一空棕色试剂瓶。根据样本量按试剂二：蒸馏水 =0.2mL：2.8mL(约18S(的比例进行稀释 ，现用现配 ，使用时置于冰上。

4、试剂四： 临用前加入 40mL 提取液一 ，用不完的试剂分装后-20℃可保存 4 周。避免反复冻融。

b试剂五： 临用前加入 2.5mL 试剂一 ，用不完的试剂分装后-20℃可保存 4 周 ，避免反复冻融 ，使用时置于冰上。

6、标准品： 10μmol/mL 谷氨酰胺标准液。

产品说明 ：

谷氨酰胺(Glutamine)简称 Gln ，是谷氨酸的酰胺 ，是组成蛋白质的重要氨基酸之一 ， 同时谷氨酰胺也是三羧酸循环中α-酮戊二酸的主要来源。谷氨酰胺在生物体内以游离态和结合态两种状态存在，游离的谷氨酰胺是在生物体代谢中起着重要作用，其代谢占细胞和血液循环中自由氨基酸的 60%以上。游离谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化作用下转变为谷氨酸 ，谷氨酸脱氢酶(GDH)催化谷氨酸和 NAD 生成α-酮戊二酸、NADH 和 NH4 +，在 1-mPMS 作用下 ，WST 可与 NADH 反应 ，产生水溶性 formazan ，其在 450nm 处有吸收峰 ，据此可计算谷氨酰胺含量。

注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、氯仿、 1mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量）

1、组织 ：按照样本质量(g) ：提取液一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织 ，加入 1mL 提取液一)加入提取液一，冰浴匀浆；12000g4℃离心 5min，取上清加入 500µL提取液二，剧烈振荡 5min，12000g4℃离心 5min，取上层液体(呈清澈状态)置冰上待测(中层浑浊物质和下层液体不需要)。

2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量(10⁴个) ：提取液一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液一)加入提取液一，超声波破碎细菌或细胞(温度 4℃,功率 200W，超声 3s ， 间隔 7s ，总时间 3min)，12000g4℃离心 5min，取上清加入 500µL 提取液二，剧烈振荡5min，12000g4℃离心 5min，取上层液体(呈清澈状态)置冰上待测(中层浑浊物质和下层液体不需要)。

3、血清(浆)等液体样本：取 500µL 样本加入 500µL 提取液二(若溶液浑浊则需先离心后取上清)，剧烈振荡 5min ，12000g4℃离心 5min，取上层液体(呈清澈状态)置冰上待测(中层浑浊物质和下层液体不需要)。

注：如果需要测蛋白浓度 ，需在加提取液二之前测定蛋白浓度。

二、测定步骤

1、可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至450nm，用蒸馏水调零。

2、0.4 μmol/mL 标准溶液的稀释：取40μL10μmol/mL 谷氨酰胺标准液，加入960μL 蒸馏水，充分混匀 ，配制成0.4 μmol/mL 标准溶液使用，现用现配。 (实验中每管需要160μL，为减小实验误差，故配制大体积。)

3、在 EP 管中按下表步骤加样

三、GOGAT 活性计算

(1) 按样本蛋白质浓度计算(蛋白浓度需自行测定）：

      谷氨酰胺含量(μmol/mgprot) =ΔA 测定 ×C 标准÷ΔA 标准 ×V 样总÷ (Cpr×V 样总) =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷Cpr。

(2) 按样本质量计算：

      谷氨酰胺含量(μmol/g 质量) =ΔA 测定 × C 标准÷ΔA 标准 ×V 样总÷W =ΔA 测定 ×0.4÷ΔA标准÷W。

(3) 按细菌或细胞数量计算：

      谷氨酰胺含量(μmol/10⁴cell) =ΔA 测定 ×C 标准÷ΔA 标准×V 样总÷N =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA标准÷N。

(4) 按照液体体积计算：

      谷氨酰胺含量(μmol/mL) =ΔA 测定 ×C 标准÷ΔA 标准 =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准 C 标准：标准溶液浓度 ，0.4 μmol/mL；V 样总 ：加入提取        液一之后的样本体积,1mL； Cpr：样本蛋白质浓度 ,mg/mL；W：样本质量 ,g； N：细胞数量,万个。

注意事项：

1、如果需要测蛋白浓度 ，需在加提取液二之前测定蛋白浓度。

2、如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或者延长时间，例如 12000g4℃离心 5min。

3、ΔA 测定的测定范围在 0.005-0.7 之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值 ，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定，如果测定吸光值小于线性范围吸光值，需要增加样本量后再次测定 ，注意同步计算公式。

实验实例：

1、取 0.1468g 草莓，将样本进行前处理，用蒸馏水稀释 2 倍后按照测定步骤操作，用 1mL玻璃比色皿测定吸光度并计算 A 测定 =0.535，A 对照 =0.1，∆A 测定 =0.435，A 标准 =0.547， A 空白 =0.067，ΔA 标准 =0.48。按样本质量计算 Gln 含量得：谷氨酰胺含量(μmol/g 质量) = ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷W ×2 =4.939μmol/g 质量。

2、取 0.12g 兔肌肉，将样本进行前处理，用蒸馏水稀释 2 倍后按照测定步骤操作，用 1mL玻璃比色皿测定吸光度并计算 A 测定 =0.351 ，A 对照 =0.136 ，∆A 测定 =0.215 ，A 标准 =0.547 ，A 空白 =0.067 ，ΔA 标准 =0.48。按样本质量计算 Gln 含量得 ：谷氨酰胺含量(μ mol/g 质量) =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷W ×2 =2.986μmol/g 质量。

3、取0.5mL羊血清，按照测定步骤操作，用 1mL 玻璃比色皿测定吸光度并计算 A 测定=0.402，A对照 =0.253，∆A 测定 =0.149，A 标准 =0.547，A 空白 =0.067，ΔA 标准 =0.48。按液体体积计算 Gln 含量得：谷氨酰胺含量(μmol/mL) =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷W =0.124 μmol/mL。