谷氨酰胺(Gln)含量检测试剂盒 ; 100T/48S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体70mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体15mL×1瓶(自备) | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体10mL ×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂六 | 液体8mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、提取液二 ：氯仿 ，需自备。
2、试剂二：试剂质量很小，有可能肉眼观察不到，直接使用即可。临用前取一支加入 0.2mL蒸馏水 ， -20℃分装可保存 4 周 ，避免反复冻融。
3、试剂二工作液 ：根据样本量按试剂二 ：蒸馏水 =0.05mL： 0.7mL（约 18S）的比例进行稀释 ，现用现配 ，使用时置于冰上。
4、试剂四： 临用前加入 20mL 提取液一 ，用不完的试剂分装后-20℃可保存 4 周。避免反复冻融。
5、试剂五： 临用前加入 1.5mL 试剂一 ，用不完的试剂分装后-20℃可保存 4 周。避免反复冻融 ，使用时置于冰上。
6、标准品：10μmol/mL 谷氨酰胺标准液。
产品说明 ：
谷氨酰胺(Glutamine)简称 Gln ，是谷氨酸的酰胺 ，是组成蛋白质的重要氨基酸之一。 同时谷氨酰胺也是三羧酸循环中α-酮戊二酸的主要来源。谷氨酰胺在生物体内以游离态和结合态两种状态存在，游离的谷氨酰胺是在生物体代谢中起着重要作用，其代谢占细胞和血液循环中自由氨基酸的 60%以上。游离谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的催化作用下转变为谷氨酸 ，谷氨酸脱氢酶(GDH)催化谷氨酸和 NAD 生成α-酮戊二酸、NADH 和 NH4 +，在 1-mPMS 作用下 ，WST 可与 NADH 反应 ，产生水溶性 formazan ，其在 450nm 处有吸收峰 ，据此可计算谷氨酰胺含量。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品 ：
酶标仪/可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、氯仿、96 孔板/微量玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、组织 ：按照样本质量(g) ：提取液一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织 ，加入 1mL 提取液一)加入提取液一，冰浴匀浆；12000g4℃离心 5min，取上清加入 500µL提取液二，剧烈振荡 5min，12000g4℃离心 5min，取上层液体(呈清澈状态)置冰上待测(中层浑浊物质和下层液体不需要)。
2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量(10 ⁴个) ：提取液一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液一)加入提取液一 ，超声波破碎细菌或细胞(温度 4℃,功率 200W ，超声 3s， 间隔 7s ，总时间 3min)，12000g4℃离心 5min，取上清加入 500µL 提取液二，剧烈振荡 5min，12000g4℃离心 5min ，取上层液体(呈清澈状态)置冰上待测(中层浑浊物质和下层液体不需要)。
3、血清(浆)等液体样本 ：取 500µL 样本加入 500µL 提取液二(若溶液浑浊则需先离心后取上清)，剧烈振荡 5min ，12000g4℃离心 5min，取上层液体(呈清澈状态)置冰上待测(中层浑浊物质和下层液体不需要)。
注：如果需要测蛋白浓度 ，需在加提取液二之前测定蛋白浓度。
二、测定步骤
1、酶标仪/可见分光光度计预热 30min 以上 ，调节波长至 450nm ，可见分光光度计用蒸馏水调零。
2、0.4 μmol/mL 标准溶液的稀释 ：取 40μL10μmol/mL 谷氨酰胺标准液 ，加入 960μL 蒸馏水 ，充分混匀 ，配制成0.4 μmol/mL 标准溶液使用，现用现配。(实验中每管需要 40μL，为减小实验误差，故配制大体积。
3、在EP管中按下表步骤加样
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 40 | 40 | - | - |
标准溶液 | - | - | 40 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 40 |
试剂二工作液 | 40 | - | 40 | 40 |
试剂三 | 20 | 60 | 20 | 20 |
37℃酶促反应1h |
试剂四 | 160 | 160 | 160 | 160 |
试剂五 | 10 | 10 | 10 | 10 |
试剂六 | 30 | 30 | 30 | 30 |
37℃避光反应 1h，12000g 常温离心 5min ， 吸取200μL上清 ，于 450nm 处测定吸光值 ，分别记为 A 测定、A 对照、A 标准、A 空白。分别计算ΔA 测定 =A 测定-A 对照 ，ΔA 标准 =A 标准-A 空白(标准管和空白管只需做 1-2 次，每个测定管需设置一个对照管）。ΔA 测定的测定范围在 0.005-0.7 之间。 |
三、谷氨酰胺含量的计算
(1) 按样本蛋白质浓度计算(蛋白浓度需自行测定) ：
谷氨酰胺含量(μmol/mgprot) =ΔA 测定 ×C 标准÷ΔA 标准 ×V 样总÷ (Cpr×V 样总) =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷Cpr
(2) 按样本质量计算：
谷氨酰胺含量(μmol/g 质量) =ΔA 测定× C标准÷ΔA标准×V 样总÷W =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA标准÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算 ：
谷氨酰胺含量(μmol/10⁴cell) =ΔA 测定 ×C 标准÷ΔA标准×V 样总÷N =ΔA 测定×0.4÷ΔA标准÷N
(4) 按照液体样本体积计算：
谷氨酰胺含量(μmol/mL) =ΔA 测定 ×C 标准÷ΔA 标准 =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准C标准：标准溶液浓度，0.4 μmol/mL；V 样总 ：加入提取液 一之后的样本体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量 ，万个。
注意事项：
1、如果需要测蛋白浓度 ，需在加提取液二之前测定蛋白浓度。
2、如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或者延长时间，例如 12000g4℃离心 5min。
3、ΔA 测定的测定范围在 0.005-0.7 之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值 ，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定，如果测定吸光值小于线性范围吸光值，需要增加样本量后再次测定 ，注意同步计算公式。
实验实例：
1、取 0.1011g 草莓 ，将样本进行前处理 ，用蒸馏水稀释 2 倍后按照测定步骤操作 ，96 孔板测得计算 A 测定 =0.37 ，A 对照 =0.1 ，∆A 测定 =0.27 ，A 标准 =0.466 ，A 空白 =0.094， ΔA 标准 =0.372。按样本质量计算 Gln 含量得：谷氨酰胺含量(μmol/g 质量) =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷W ×2 =5.7433μmol/g 质量。
2、取 0.1081g 兔肌肉 ，将样本进行前处理 ，用蒸馏水稀释 2 倍后按照测定步骤操作 ， 96孔板测得计算 A 测定 =0.349 ，A 对照 =0.147 ，∆A 测定 =0.202 ，A 标准 =0.466 ，A 空白 =0.094 ，ΔA 标准 =0.372。按样本质量计算 Gln 含量得 ：谷氨酰胺含量(μmol/g 质量) =Δ A 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷W ×2 =4.0186μmol/g 质量。
3、取 0.5mL 羊血清 ，将样本用蒸馏水稀释 2 倍后按照测定步骤操作 ， 96 孔板测得计算 A测定 =0.155，A 对照 =0.118 ，∆A 测定 =0.037，A 标准 =0.466，A 空白 =0.094 ，ΔA 标准=0.372。按样本质量计算 Gln 含量得 ：谷氨酰胺含量(μmol/mL) =ΔA 测定 ×0.4 ÷ΔA 标准÷W ×2 =0.0796μmol/mL。
