谷胱甘肽还原酶活性系数(GRAC)检测试剂盒 ; 50T/24S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体40mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
试剂三 A | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂三 B | 液体1mL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体1.2mL ×1支 | 2-8℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂六 | 液体20 mL× 1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂七 | 液体50mL ×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二： 临用前加入1.2mL 蒸馏水 ，充分溶解 ， 2-8℃可保存 4 周；
2、试剂三：临用前取试剂三 A 加入 0.537mL 试剂三 B，充分溶解，-20℃可分装保存 4 周，避免反复冻融；
3、工作液 ：临用前根据样本量按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四 =80μL：20μL：8 μL： 20μL(128μL ， 1T)的比例配制工作液 ，现用现配；
4、试剂五：临用前加入 1.2mL 蒸馏水，充分溶解 ，-20℃可分装保存 4 周，避免反复冻融；
5、试剂五工作液 ：临用前根据样本量按照试剂五：蒸馏水 =5 μL：95μL(0.1mL ，5T)的比例配制 ，现用现配。
产品说明 ：
谷胱甘肽还原酶(GlutathioneReductase ，GR)是广泛存在于真核与原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶 ，该酶以核黄素衍生物核黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基 ，催化 NADPH还原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型谷胱甘肽(GSH) ，维持巯基和膜蛋白处于还原状态。当生物体内缺乏核黄素时 ，FAD 含量相应减少 ，GR 活性也随之降低，谷胱甘肽还原酶活性系数(GRActivationCoefficient，GRAC)迅速升高，出现唇炎、口角炎、结膜炎等临床症状。因此，GRAC 用于核黄素营养状况评价，对于早期发现缺乏病患者采取防治措施具有重要意义。GR 催化 NADPH 还原 GSSG，生成 GSH，GSH 与 5，5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(5， 5’ -dithio bis-2-nitrobenoicacid ， DTNB)反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸 ， 2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长 412nm 处有特征吸收峰，通过 412nm 处吸光度的变化可计算 GR 的活性。根据加入 FAD 前后 GR 活性的变化可计算得到 GRAC。
注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、 1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、组织样本：按质量(g)：试剂一体积(mL) =1：5~10 比例加入试剂一(建议称取 0.1g 样本，加入 1.0mL 试剂一) ，冰浴匀浆后 ，于 4℃,12000rpm 离心 10min ，弃沉淀 ，取上清液置于冰上待测。
2、细胞样本 ：按细胞数量(104) ：试剂一体积(mL) =500~1000： 1 的比例加入试剂一(建议500 万细胞加入 1.0mL 试剂一) ，冰浴超声破碎细胞(功率 200W ，超声 3s ，间隔 7s ，总时间 3min) ，然后于 4℃,12000rpm 离心 10min ，弃沉淀 ，取上清液置于冰上待测。
3、全血/红细胞： 建议取 10μL 全血/红细胞 ， 加入 990μL 试剂一 ， 充分溶血混匀 ， 于4℃,4000rpm 离心 10min ，弃沉淀 ，取上清液置于冰上待测。
4、血清/血浆等液体样本 ：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热 30min 以上 ，调节波长至 412nm ，蒸馏水调零。
2、将工作液 37℃预热 10min。
3、操作表： (在 1.5mLEP 管中加入下列试剂)
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 40 | 40 | - | - |
蒸馏水 | - | - | 40 | 40 |
工作液 | - | - | - | 40 |
试剂五工作液 | - | - | 40 | 80 |
混匀 ，37℃孵育 30min |
试剂六 | 320 | 320 | 320 | 320 |
混匀， 4000rpm 离心 10min ，取上清液于 EP 管中待测 |
上清液 | 240 | 240 | 240 | 240 |
试剂七 | 800 | 800 | 800 | 800 |
混匀， 室温静置 5min ，取 1mL 反应液于 1mL 玻璃比色皿中，测定 412 处的吸光值，分别记为 A测定、A 对 照、 A 空白。每个测定管需设置一个对照管 ，空白管只需测定 1-2 次。 |
三、GOGAT 活性计算
GRAC =(A 测定-A 空白)÷ (A 对照-A 空白)
注意事项：
1、建议准备核黄素水平正常的样本进行检测 ，方便与核黄素缺乏的样本进行比较；如果没有核黄素水平正常的样本 ，可参考一般核黄素水平正常的样本 GRAC 为 0.9-1.2；
2、如果样本测定管吸光值大于 1.5，建议将样本用试剂一稀释后进行测定；如果样本测定管吸光值接近空白管，可适当增大样本质量重新提取或提高加样表中样本体积，对照管、空白管蒸馏水需进行相应调整。
3、样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 0.11mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例：
1、取 0.1051g 大鼠肾脏样本，加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆，离心后取上清 ，按照测定步骤操作 ，用 1mL 玻璃比色皿测得 ：A 测定 =0.482 ，A 对照 =0.465 ，A 空白 =0.084，计算得：GRAC =(A测定-A空白)÷ (A对照-A空白) =1.045。
2、取 10μL人红细胞，加入990μL 试剂一，充分溶血混匀，离心后取上清，按照测定步骤操作，用 1mL 玻璃比色皿测得：A 测定 =0.530，A 对照 =0.529，A 空白 =0.084 ，计算得： GRAC =(A 测定-A 空白)÷ (A 对照-A 空白) =1.002。
3、取马血清样本，直接按照测定步骤操作，用 1mL 玻璃比色皿测得：A 测定 =0.453 ，A对照=0.451，A空白=0.084，计算得：GRAC =(A 测定-A空白)÷ (A对照-A空白) =1.005。
