肌酸含量检测试剂盒 ; 50T/24S

肌酸含量检测试剂盒 ; 50T/24S

试剂盒组成和配制：

溶液的配制：

试剂一： 临用前每支加入1 mL 蒸馏水 ，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存。试剂二： 临用前每支加入0.2 mL 蒸馏水 ，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存。试剂三：临用前每支加入0.5 mL 蒸馏水(100T/48S），充分溶解。为方便储存故多给一支。用不完的试剂分 装后-20℃保存。

试剂四：临用前根据试验所需用量，按照试剂四A液：试剂四B液=1:1，充分混匀，现用现配。

标准品： 1 mg一水肌酸。 临用前加入1 mL蒸馏水，充分溶解, 即1mg/mL一水肌酸标准储备液。临用前取20μL和80μL蒸馏水混合配制成200μg/mL作为标准溶液待测。现用现配。

产品说明 ：

肌酸(Creatine)是一种含氮化合物 ， 自然存在于脊椎动物体内 ，能够辅助为肌肉和神经细胞提供能量。肌酸可由精氨酸(arginine)、甘氨酸(glycine)及甲硫氨酸(methionine)三种氨基酸合成 ，可由人体自行合成 ，也可以从食物中摄取。大约 95%的肌酸存在于骨骼肌中 ，主要存在形式为磷酸肌酸。肌酸作为一种补充剂主要通过增加肌肉质量 ，增强运动表现能力。

肌酸也被作为神经肌肉疾病的一种治疗药被广泛研究，它可能有助于保护神经和改善细胞生物功能状态。肌酸酶偶联肌氨酸氧化酶，可将肌酸转化为甘氨酸、甲醛、过氧化氢，过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚 ，生成有色化合物 ，在 505nm 有特征吸收峰。

注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、 1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量）

1、细菌、细胞样本的制备 ：按照细胞数量(104 个):提取液一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300W，超声 3 秒，间隔 9 秒 ，总时间 5min) ；于 4℃,12000g 离心 10min ，取 0.8mL 上清液 ，再加入 0.15mL提取液二 ，4℃,12000g 离心 10min 后取上清待测。

2、组织样本的制备：按照质量(g):提取液一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液一)加入提取液一，冰浴匀浆后于 4℃,12000g 离心 10min，取 0.8mL上清液 ，再加入 0.15mL 提取液二 ，4℃,12000g 离心 10min 后取上清待测。

3、血清(浆)：取 100μL 血清(浆)加入 1mL 提取液一，4℃,12000g 离心 10min，取 0.8mL上清液 ，再加入 0.15mL 提取液二 ，4℃,12000g 离心 10min 后取上清待测。

二、测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 505nm ,蒸馏水调零。

2、按下表步骤加样：

注：空白管只需做 1-2 次。

三、肌酸含量计算

1、计算公式

(1) 按照蛋白浓度计算

       肌酸含量(μg/mgprot) =C 标 ×ΔA 测÷ΔA 标×V 样÷ (V 样 ×Cpr)×0.879=175.8 ×ΔA 测÷Δ A 标÷Cpr

(2) 按照样本质量计算

      肌酸含量(μg/g 质量) =C 标 ×ΔA 测÷ΔA 标 × (V 上清+V 提取液二) ÷ (W ×V 上清÷V 提取液一) ×0.879 =208.76 ×ΔA 测÷ΔA 标÷W

(3) 按照细菌或细胞数量计算

      肌酸含量(μg/10⁴cell)=C标×ΔA测÷ΔA 标 × (V 上清+V 提取液二)÷ (细胞数量 ×V 上清÷V提取液一)×0.879 =208.76 ×ΔA测÷ΔA 标÷细胞数量

(4) 按照血清(浆)体积计算

      肌酸含量(μg/mL) =C 标×ΔA 测÷ΔA 标 × (V 上清+V 提取液二) ÷ [V 液体 ×V 上清÷ (V 提取液一+V 液体)] ×0.879 =2296.39 ×ΔA 测÷ΔA          标 C标 ：标准管浓度,200μg/mL；V 样：加入样本体积，50μL =0.05mL； V 上清 ：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液一：加入提取液一体          积,1mL；V 提取液二：加入提取液二体积,0.15mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度,mg/mL；细胞数量：以 10⁴计；V 液体：液体样本体        积，0.1mL；0.879：换算系数，一水肌酸相对分子质量 149.15，无水肌酸相对分子质量 131.13，0.879=131.13÷ 149.15。

注意事项：

1、显色完成后 ，请在10min之内完成检测。

2、提取液中含有蛋白沉淀剂 ，提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酐含量需要另取组织或血清(浆)， 即取相同质量(体积)的组织( 血清浆)用1.1875mLPBS(生理盐水)匀浆(相当于提取步骤最终样本上清液)，用 BCA 法进行蛋白浓度测定。

3、如果测定吸光值超过标准管吸光值，建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定。如果测定吸光值过小，建议增大样本量后再进行测定。

实验实例：

1、取 0.1g 大鼠肌肉加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心 ，取 0.8mL 上清后加 0.15mL提 取 液 二 ， 离 心 取 上 清 后 按 照 测 定 步 骤 操 作 ， 测 得 计 算 Δ A 测 定 =A 测 定 -A 对 照 =0.752-0.012 =0.74，ΔA 标准 =A 标准-A 空白 =0.672-0.014 =0.66。按样本质量计算含量得 ：肌酸含量(μg/g 质量) =208.76 ×ΔA÷ΔA 标÷W =2340μg/g 质量。

2、取 100μL 牛血清加入 1mL 提取液一，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA 测定 =A 测定-A 对照 =0.061-0.016 =0.045，ΔA标 准 =A 标 准 -A 空 白 =0.672-0.014 =0.66 。 按 照 液 体 体 积 计 算 含 量 得 ： 肌 酸 含 量 (μ g/mL) =2296.39 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 =156.57μg/mL 血清。