线粒体呼吸链复合物V(omplex V)检测试剂盒 ; 20管/10样
反应原理：
线粒体呼吸链复合物 V，通常称为 ATP 合成酶（ATP synthase）、F 型 ATP 酶（F type ATPase）和 F1F0 ATP 酶（F1F0 ATPase），是线粒体氧化磷酸化的终极反应。其分子量为 500KD，含有十六个亚单位，其中两个：ATP酶 6 和8 为线粒体 DNA 编码的。ATP 酶主要有两个结构域：F0 为质子通道，由几个膜蛋白构成，包括 a 、 b 、c 、d 、e 、F6 、A6L 、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和 F1 催化活性结构域，由水溶性的α3 β3 γδε蛋白构成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的 ATP 合成酶。
复合物 V 的主要功能在于产生大部分细胞所需的能量 ATP 。ATP 的合成需要线粒体内膜电子传递到氧分子时，呼吸链蛋白所产生的质子梯度变化。质子通过 F0 结构域传递到基质，激活 F1 催化活性结构域，促使 ATP合成。
该酶异常会导致心肌和神经系统疾病。基于 ATP ，在寡霉素参与下，受到 F1F0 ATP 酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide ；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析 F1F0 ATP 酶活性。其反应系统为：
F1F0 ATPase
ATP = ADP + Pi
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
（高吸收峰） （低吸收峰）
试剂组成：
缓冲液(Reagent A） | 20毫升 |
反应液(Reagent B） | 2.5毫升 |
稀释液(Reagent C） | 2 毫升 |
底物液(Reagent D） | 500微 |
专性液(Reagent E） | 200微升 |
产品说明书 | 1份 |
保存方式：
-20℃冰箱避光保存，避免反复冻融；反应液（Reagent B）避免光照，有效保证6月。
用户自备：
比色皿：用于比色分析的容器
双波长分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
实验步骤：
(一)、背景对照测定
1、移取780微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入100微升反应液（Reagent B）
3、加入20微升底物液（Reagent D）
4、放进30℃培养箱里静置3分钟
5、加入 100微升阴性液（Reagent C）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数 1 分钟或5分钟
(二)、样品活性测定
1、移取780微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入100微升反应液（Reagent B）
3、加入20微升底物液（Reagent D）
4、放进30℃培养箱里静置 3分钟
5、加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数 0分钟－340波长读数1分钟或 5分钟
(三)、样品非特异活性测定
验开始前，移取100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）到 1.5毫升离心管，加入20微升专性液（Reagent E），混匀后，放进 30℃培养箱里孵育15分钟。然后置于冰槽里备用
1、移取760微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入100微升反应液（Reagent B）
3、加入20微升底物液（Reagent D）
4、放进30℃培养箱里静置3分钟
5、加入120微升上述预处理的待测样品
6、上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或5分钟
样品活性计算：
(1)、样品活性（总活性或非特异活性）
(样本读数-背景读数)×体系容量(1ml） ×样本稀释倍数 ÷样本蛋白浓度样本容量(0.1ml） ×6.22(毫摩尔吸光系数)×反应时间(1或者5分钟)(mgprot/ml)单位：μmol NADH/min/mgprot
(2)、样品特异活性
样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性（蛋白浓度可通过总蛋白定量考马斯亮蓝法试剂盒测定）
