ATP含量检测试剂盒 ; 50T/48S

ATP含量检测试剂盒 ; 50T/48S

试剂盒组成和配制：

溶液的配制：

1、提取液 ：低温条件下，可能有结晶析出， 放于60℃水浴加热溶解即可，不影响使用；

2、试剂二： 临用前加入，7 mL 蒸馏水充分溶解，可加热促进溶解，用不完的试剂  2-8℃保存 4 周；

3、试剂四：临用前取 1支加入 0.2mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2 周，避免反复冻融；

4、试剂五： 临用前加入 3.2 mL 蒸馏水充分溶解 ，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周 ，避免反复冻融；

5、试剂六：临用前取1支加入0.25 mL蒸馏水备用，用不完的试剂-20℃分装保存2 周，避免反复冻融；

6、标准品：5 mg ATP。临用前加入  0.826 mL  蒸馏水配成 10μmol/mL 的 ATP 标准溶液，用不完的试剂-20℃ 分装保存 4 周 ， 避免反复冻融；

7、0.3125μmol/mL  标准溶液的配制： 临用前吸取  20μL 10  μmol/mL  的 ATP 标准溶液和 620μL 蒸馏水混合配制成 0.3125μmol/mL 标准溶液 ，用于标准管的测定；

8、工作液的配制： 临用前请按试剂二： 试剂三： 试剂四：试剂五： 试剂六 =1mL：1mL：0.1mL： 0.4mL： 0.1mL 的比例配制（2.6mL ，约  10T  的量），现配现用。

产品简介：

TP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定 ATP 含量并且计算能荷 ，能够反映能量代谢状态。HK 催化葡萄糖和 ATP 合成 6-磷酸葡萄糖 ， 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH ，WST-1 可与 NADPH  反应 ，产生水溶性  formazan ，在 450nm 下有特征吸收峰。

注意 ：实验之前建议选择  2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、 1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量）

1、血清（浆） 中 ATP 的提取 ：按照血清（浆）体积（ mL）：提取液体积(mL为1： 5~10 的比例（建议取约  0.1mL 血清（浆），加入 1mL 提取液）混合 ， 充分震荡，10000g， 4℃离心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入  500μL 的氯仿充分震荡混匀，10000g4℃离心  3min ，取上清 ， 置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

2、组织中 ATP   的提取： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为  1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g   组织 ，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆, 10000g 4℃离心 10min ，取上清至另一 EP  管中 ，加入  500μL  的氯仿充分震荡 混匀,10000g 4℃离心  3min ，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

3、细胞或细菌中ATP的提取 ：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清 ，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液 体积（ mL）为  500~1000： 1的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎（冰浴 ，功率  200W ，超声 2s ，停  1s ，总时间1min），10000g 4℃离心  10min；取上清液至另一 EP管中 ，加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定）。

注：以上提取过程严格控制在冰浴条件下进行。

二、测定步骤

1、可见分光光度计预热30min 以上，调节波长到450nm ，蒸馏水调零。

2、试剂一置于 37℃水浴锅/恒温培养箱中预热 15min 以上。

3、操作表：(按下表在1.5mLEP管中加入相应试剂）

三、ATP 含量计算

计算公式

1、血清(浆)中ATP含量计算

      ATP 含量(μmol/mL) = C 标准 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 ×（V 提取+V 血清（浆）÷V 血清(浆)= 3.4375 ×ΔA 测定÷ΔA 标准

2、按样本质量计算

      ATP 含量(μmol/g 质量)= C 标准 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 ×V 提取÷W =0.3125 ×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

3、按蛋白浓度计算：

      ATP 含量(μmol/mg prot)= C标准 × ΔA测定÷ΔA标准 × V样本 ÷ (V 样本 ×Cpr)=0.3125×ΔA 测定÷ΔA标准÷Cpr

4、按细菌或细胞数量计算

      ATP含量(μmol/10⁴cell)= C 标准 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 ×V 提取÷N = 0.3125 ×ΔA 测定÷ΔA 标准÷NC标准 ：标准溶液浓度,0.3125μmol/mL；        V 提取 ：加入的提取液体积,1mL；V 血清（浆）：血清（浆)体积，0.1mL；V 样本：反应体系中加入的样本体积 ，0.1mL；W：样本质量，g；          Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；N ：细胞或细菌总数,按 10⁴个。

注意事项：

1、加入提取液离心后的上清若为浑浊为正常现象。

2、如果 ΔA 测定>1.5 ，建议将样本用蒸馏水稀释后进行测定。注意计算公式中乘以稀释倍数；如果吸光值过低 或接近空白 ，建议统一放置于  37℃水浴锅/恒温培养箱中培养2h或更长时间后再次测定 ， 也可以加大样本量后进 行测定 ，注意同步修改计算公式。

3、提取液中含蛋白变性成分 ，若按蛋白浓度计算需要另取样本重新计算。

实验实例：

1、取 0.108g 小鼠脑加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心 10min，取上清至另一 EP  管中 ，加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀,10000g 4℃离心3min ，取上清 ，置冰上按照测定步骤操作，使用 1mL 玻璃比色皿测得计算ΔA 测定 =0.283-0.154 =0.129 ，ΔA标准 =A 标准-A 空白 =0.569-0.154 =0.415,按样本质量计算含量得 ：ATP 含量(μmol/g 质量) =0.3125 ×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W =0.899μmol/g 质量。

2、取0.111g 绿萝叶片加入1mL 提取液进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心 10min ，取上清至另一 EP 管中 ，加入 500μL 的氯仿充分震荡混匀 ， 10000g 4℃离心 3min ，取上清 ，置冰上按照测定步骤操作,使用 1mL 玻璃比色皿测得计算ΔA 测定 =0.387-0.154 =0.233 ， ΔA 标准 =A 标准-A 空白 =0.569-0.154 =0.415,按样本质量计算含量得：ATP 含量(μmol/g质量） =0.3125 ×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W =1.58μmol/g 质量。