D-乳酸(D-LA)含量检测试剂盒 ; 100T/48S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体4mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前取一支加入 160μL 蒸馏水溶解。2-8℃可以保存 4 周(该试剂为冻干试剂，可能存在肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同）；
2、试剂二工作液的配制： 临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V） =10μL： 90μL（1T)的比例配制 ，现用现配 ，用多少配多少；
3、试剂三： 临用前加入 15 mL 蒸馏水混匀 ，可分装后-20℃保存 ，避免反复冻融,-20℃保存 4 周；
4、标准品： 1000μmol/mL D-乳酸标准液。 临用前取 20μL 1000μmol/mL D-乳酸标准液和 1980μL 蒸馏水混合配成 10μmol/mL 标准溶液；再吸取 20μL 10μmol/mL 标准溶液和 620μL 蒸馏水混合配成 0.3125μmol/mL 标准溶液备用。
产品说明 ：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物 ，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关 ，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。 D-乳酸在 D-乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使 NAD+还原生成 NADH 和 H+，在 1-mPMS作用下，WST-1可与 NADH 反应，产生水溶性 formazan，其在 450nm 处有最大吸收峰，据此可计算 D-乳酸含量。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品 ：
可见分光光度计、分析天平、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、离心机、 1m 玻璃比色皿、水浴锅/恒温培养箱、蒸馏水和冰。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、组织 ：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g ，加入1mL 提取液一）加入提取 液一 ，冰浴匀浆后于 4℃ , 12000g 离心 10min ，取 0.8mL 上清液 , 再缓慢加入 0.15mL 提取液二,缓慢吹打混匀至 无气泡产生,4℃ 12000g 离心10min 后取上清待测。
2、细胞 ：按照细胞数量（10⁴个)：提取液一体积（ mL） 为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液 一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒 ，间隔7 秒，总时间 3min）；于 4℃ , 12000g 离心 10min，取 0.8mL 上清液，再缓慢加入 0.15mL提取液二 ，缓慢吹打混匀至无气泡产生 ， 4℃12000g 离心 10min 后取上清待测。
3、血清（浆）等液体 ：取 100μL 液体加入 1mL 提取液一 ，4℃ 12000g 离心 10min ，取0.8mL 上清液 ，再缓慢加入 0.15mL 提取液二 ， 缓慢吹打混匀至无气泡产生 ， 12000g 离心 10min 后取上清待测。
注：提取液二需缓慢加入 ，加入后会产生大量气泡 ，建议使用 2mLEP 管进行操作。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上,波长调至 450nm,蒸馏水调零。
2、加样表：(按顺序将下列试剂加在EP管中）
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 |
样本 | 20 | 20 | - | - |
标准溶液 | - | - | 20 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 20 |
试剂一 | 90 | 90 | 90 | 90 |
试剂二标准溶液 | 20 | - | 20 | 20 |
试剂三 | 40 | 40 | 40 | 40 |
试剂四 | 30 | 30 | 30 | 30 |
充分混匀,于 37℃水浴锅/恒温培养箱避光准确反应30min ，取全部反应液到 1mL 比色皿中 ，于450nm 处测定吸光值，分别记为 A 测定管，A 对照管，A 标准管， A 空白管，计算ΔA 测定 =A 测定管-A 对照管； ΔA 标准 =A 标准管-A 空白管。每个测定管需设置一个对照管， 空白管和标准管只需测定1-2次。 |
三、D-乳酸含量的计算
1、按照蛋白含量计算
D-LA 含量(μmol/mgXprot)=ΔA 测定÷ (ΔA 标准÷C标准)×V 样本÷(V 样本 ×Cpr)= 0.3125×ΔA 测定÷ΔA标准÷Cpr
2、按照样本质量计算
D-LA含量(μmol/g质量)=ΔA 测定 ÷ (ΔA 标准÷C 标准) × (V提取液二) ÷（W× V上清÷V 提取液一)=0.3711×ΔA 测定÷ΔA标准÷W
3、按照细胞数量计算
D-LA 含量(μmol/10⁶cell)= ΔA 测定÷ (ΔA 标准÷C标准)× (V 上清+V 提取液二)÷(N ×V 上清÷V 提取液一)= 0.3711 ×ΔA测定÷ΔA标准÷N
4、按照液体体积计算
D-LA 含量(μmol/mL）=ΔA测定÷(ΔA 标准÷C 标准)×（V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体 ×V 上清÷（V 提取液一+V 液体)] =4.082×ΔA测定÷ΔA 标准C标准：标准溶液浓度, 0.3125μmol/mL；V样本：加入的样本体积,0.1mL；W：样本质量,g；Cpr：样本蛋白质浓度, mg/mL,蛋白浓度需自 行测定；V上清：提取时上清液体积,0.8mL；V 提取液二：加入的提取液二体 积,0.15mL；V 提取液一：加入的提取液一体积,1mL;N：细胞数量, 以10⁶计；V 液体 ：液体样本体积,0.1mL。
注意事项：
1、提取液一中含有蛋白质沉淀剂,因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。
2、ΔA 测定的测定范围在 0.01- 1.2 之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定 ，如果测定吸光值小于线性范围吸光值,需要增加样本量后再次测定 ，注意同步计算公式。
实验实例：
1、取 0.10⁴g 兔肌肉加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后离心，取 0.8mL 上清后加 0.15mL提取液二 ， 离心取上清后 按照测定步骤操作 ， 使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定管 =A 测定-A 对照 =0.321-0.179 =0.142，ΔA 标准 =A 标准管-A 空白管 =0.405-0.122 =0.283，按样本质量计算含量得：D-LA 含量(μmol/g 质量） = 0.3711 ×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W =1.7904 μmol/g 质量。
2、取100μL 牛血清加入 1mL 提取液一，离心取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清， 之后按照测定步骤操作，用96孔板测定后计算ΔA测定=A测定-A对照 =0.271-0.07 =0.201,带入标准曲线y=0.0062x-0.0143 ，计算 x =34.726。按照液体体积计算含量得 ：肌酸含量(μg/mL) =11.482×x =398.7μg/mL。
