D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性检测试剂盒 ; 100T/48S
测定意义：
乳酸脱氢酶（ Lactate dehydrogenase ， LDH）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中 ，是糖酵解途径的末端酶 ，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应 ，伴随着 NAD+/NADH 之间互变。根据其催化底物-乳酸构型的不同，可分为 D-乳酸脱氢酶（D-LDH， EC 1.1.1.28） 与 L-乳酸脱氢酶（ L-LDH ， EC 1.1.1.27）。 D-LDH 催化 NAD+氧化 D-乳酸生成丙酮酸 ，丙酮酸进一步与 2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙 ，在碱性溶液中显棕红色 ，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体7mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体7mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二： 临用前加入 0.8 mL 蒸馏水 ，充分溶解。用不完的试剂分装保存,-20℃可保存 4 周 ，避免反复冻融；
2、标准品 ：20μmol/mL 丙酮酸钠溶液。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品 ：
可见分光光度计、分析天平、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、离心机、1m 玻璃比色皿、水浴锅/恒温培养箱、蒸馏水和冰。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、细菌或培养细胞 ：先收集细菌或细胞到离心管内 ，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个)：提取液体 积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次） ； 8000g 4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织 ， 加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。 8000g 4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。
3、血清(浆)等其他液体： 直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、标准溶液的稀释将20μmol/mL丙酮酸钠标准溶液用蒸馏水进行稀释得到2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125μmol/mL 标准溶液备用。
3、标准溶液稀释可参考下表：
序号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 标准溶液体积(µL) | 蒸馏水体积(µL) | 稀释后浓度(μmol/mL) |
1 | 20 | 100 | 900 | 2 |
2 | 2 | 150 | 100 | 1 |
3 | 1 | 100 | 100 | 0.5 |
4 | 0.5 | 100 | 100 | 0.25 |
5 | 0.25 | 100 | 100 | 0.125 |
6 | 0.125 | 100 | 100 | 0.625 |
7 | 0.0625 | 100 | 100 | 0.3125 |
8 | 0.03125 | 100 | 100 | 0.015625 |
9 | 0.015625 | 100 | 100 | 0.0078125 |
备注：实验中每个标准管需50µL标准溶液。 |
4、在1.5mLEP 管/96孔板按下表步骤加样
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 |
待测样本 | 10 | 10 | - | - |
标准液 | - | - | 10 | - |
试剂一 | 50 | 50 | 50 | 50 |
试剂二 | 10 | - | - | - |
蒸馏水 | - | 10 | 10 | 20 |
充分混匀， 37℃水浴 15min |
试剂三 | 50 | 50 | 50 | 50 |
充分混匀， 37℃水浴 15min |
试剂四 | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混匀，室温静置,3min,取200μL 转移至微量玻璃比色皿或96孔板中，450nm下测定吸光度， 计算ΔA 测定 =A 测定-A对照 ,ΔA 标准 =A标准-A 空白。空白管和标准曲线只需做1-2 次，每个测定管需要设一个对照管。 |
三、D-LDH活性计算
1、标准曲线的绘制
根据标准管的浓度(x,μmol/mL)和吸光度ΔA 标准(y ,ΔA 标准)建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA 测定(y ,ΔA 测定)带入公式计算样本浓度 (x,μmol/mL）。
2、D-LDH 活性计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义 ：
每mg组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
D-LDH 活性（ U/mg prot) = x×V 样÷（ Cpr×V 样) ÷T × 10³×F =66.67×x÷Cpr×F
(2) 按样本质量计算
单位的定义：
每g组织每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
D-LDH 活性(U/g 质量)= x×V 样÷ (W÷V 样总 ×V 样)÷T × 10³×F =66.67×x÷W × F
(3) 按细菌/细胞数量计算
单位的定义：
每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
D-LDH活性(U/10⁴cell)= x×V 样÷(N÷V样总×V样)÷T×10³×F =66.67×x×F÷N
(4) 按血清(浆)等液体体积计算
单位的定义：
每mL 血清（浆)等液体每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。
D-LDH 活性(U/mL) =x×V 样÷V 样÷T × 10³×F =66.67×x×FV 样：反应体系中加入的样本体积,0.01mL；V 样总：加入的提取液体积,1mL； T;反应时间，15min； Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N ：细胞或细菌数量，以万计；10³ ：单位换算系数,1μmol/mL =10³nmol/mL；F：样本稀释倍数。
注意事项：
如果测定管吸光值接近空白或 ΔA 测定过低，可适当加大样本量后重新测定；如果测定管吸光值超过1.5或 ΔA 测定超过0.4，建议将样本用提取液适当稀释后进行测定。注意同步修改计算公式。
实验实例：
1、取 0.109g 兔肾加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA 测定 =A 测定-A 对 照 =0.425-0.298 =0.127,带入标准曲线 y =0.5379x+0.0087 ，计算 x =0.220 ,按样本质量计算酶活得：D-LDH 活性（ U/g 质量） =66.67×x÷W × F =134.520U/g 质量
2、取 0.1018g 拟南芥加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆 ，按照测定步骤操作 ，用 96 孔板测计算ΔA 测定 =A 测定-A 对照 =0.236-0.196 =0.04 ,带入标准曲线 y =0.5379x+0.0087，计算 x =0.058 ,按样本质量计算酶活得：D-LDH 活性(U/g 质量) =66.67×x÷W × F =38.109 U/g 质量
3、取500 万细胞加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作, 用 96 孔板测得计算ΔA 测定 =A 测定-A 对照 =0.225-0.174 =0.051,带入标准曲线 y =0.5379x+0.0087，计算x =0.079 ,按细菌/细胞数目计算酶活得：D-LDH 活性（ U/10⁴cell） =0.133×x×F =0.010 U/10⁴ cell
4、取 10μL 胎牛血清 ，按照测定步骤操作 ，用 96 孔板测得计算ΔA 测定 =A 测定-A 对照 =0.322-0.201 =0.121,带入标准曲线 y =0.5379x+0.0087，计算 x =0.209 ,按液体体积计算酶活得：D-LDH 活性(U/mL) =66.67×x×F =13.919 U/mL
