L-乳酸(L-LA)含量检测试剂盒 ; 50T/24S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体5mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体24mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前按试剂二(V)：蒸馏水(V) =10μL：450μL 的比例配制试剂二溶液，现用现配；
2、试剂四：临用前每瓶加入 8 mL 蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融 ， -20℃保存 4 周；
3、标准品：临用前加入1.04 mL 蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液 2-8℃保存 4 周。
产品简介：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关 ， 乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使 NAD+还原生成 NADH 和 H + ,H+传递给 PMS 生成的 PMSH2还原 MTT 生成紫色物质 ，在 570nm 处有特征吸收峰。
技术指标：
低检出限：0.0387μmol/mL
线性范围：0.039-1μmol/mL
注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、研钵/匀浆器、离心机、可见分光光度计、 1mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅或者恒温培养箱、 乙醇和蒸 馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、组织 ：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g ，加入1mL 提取液一）加入提取 液一 ,冰浴匀浆后于 4℃ , 12000g 离心 10min ，取 0.8mL 上清液, 再缓慢加入 0.15mL 提取液二 ，缓慢吹打混匀至 无气泡产生 ，4℃ 12000g 离心10min 后取上清待测。
2、细胞： 按照细胞数量（10⁶个）：提取液一体积( mL）为 5~10： 1 的比例(建议5 ×10⁶个细胞加入 1mL 提取液一)， 冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒, 间隔7秒，总时间 3min）；于 4℃ , 12000g 离心 10min ，取 0.8mL 上 清液 ,再缓慢加入 0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生, 4℃12000g 离心 10min 后取上清待测。
3、血清（浆）等液体：取 100μL 液体加入1mL 提取液一，4℃12000g离心10min ，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生, 12000g 离心10min后取上清待测。
注： 提取液二需缓慢加入 ，加入后会产生大量气泡 ，建议使用 2mL EP 管进行操作。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，波长调至 570nm，乙醇调零。
2、标准液的稀释：将 100μmol/mL 的标准溶液用蒸馏水稀释为1、0.625、0.3125、 0.15625、0.078、0.039μmol/mL 的标准溶液待测。
3、标准品稀释表：
序号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 标准溶液体积(µL) | 蒸馏水体积(µL) | 稀释后浓度(μmol/mL) |
1 | 100 | 50 | 450 | 10 |
2 | 10 | 50 | 450 | 1 |
3 | 10 | 50 | 750 | 0.625 |
4 | 0.625 | 200 | 200 | 0.3125 |
5 | 0.3125 | 200 | 200 | 0.15625 |
6 | 0.15625 | 200 | 200 | 0.078 |
7 | 0.078 | 200 | 200 | 0.039 |
备注： 实验中每个标准管需 50µL标准溶液。 |
4、加样表：
| 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 |
样本(μL） | 50 | 50 | - | - |
标准液(μL） | - | - | 50 | - |
蒸馏水(μL） | - | 50 | - | 50 |
试剂一(μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂二( μL） | 50 | - | 50 | 50 |
试剂四(μL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
混匀， 置于 37℃水浴锅/恒温培养箱中培养1h |
试剂五(μL） | 30 | 30 | 30 | 30 |
试剂三( μL） | 300 | 300 | 300 | 300 |
37℃避光反应 20min 后于 25℃ , 10000rpm 离心 10min ，去上清 ，留沉淀。 |
乙醇(μL） | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
充分溶解沉淀后,于570nm 处测定吸光值 ,分别记为A 测定管,A 对照管,A 标准管，A 空白管，计算 ΔA 测定 =A 测定管-A 对照管,ΔA 标准 =A 标准管-A 空白管。（标曲和空白管只需做1-2次） |
三、乳酸含量的计算
1、标准曲线的绘制
以各标准溶液浓度为x轴，以其对应的吸光值(ΔA 标准）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入公式中得到 x( μmol/mL）。
2、乳酸含量计算
(1) 按照蛋白含量计算
L-LA 含量(μmol/mg prot)=x×V 样本÷(V 样本 ×Cpr) =x÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
L-LA 含量(μmol/g 质量)=x×（V 上清+V 提取液二)÷（W ×V 上清÷V 提取液一）=1.1875×x÷W
(3) 按照细胞数量计算
L-LA 含量(μmol/10⁶ cell） =x×(V 上清+V 提取液二) ÷ (N × V 上清÷V 提取液一)÷N=1.1875×x÷N
(4) 按照液体体积计算
L-LA含量(μmol/mL)=x×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体 ×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]=13.0625×xV样本： 加入的样本体积,0.05mL；W： 样本质量,g；Cpr：样本蛋白质浓度, mg/mL,蛋白浓度需自行测定；V 上清： 提取时上清液体积 ,0.8mL；V 提取液二 ：加入的提取液二体积 ,0.15mL；V 提取液一：加入的提取 液一体积,1mL；N：细胞数量,以百万计；V 液体：液体样本体积,0.1mL。
注意事项：
1、如果测定吸光值超过线性范围吸光值 ，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。2、提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取样本。
实验实例：
1、取1、取 0.1g 兔心加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二 ，离心取上清后稀释 5 倍 ，之后按照测定步骤操作 ，测得计算ΔA 测定 =A 测定管-A 对照管 =1.137-0.125 =1.012,根据标准曲线y =0.7826x+0.0215 ，计算 x =1.266 ，按样本质量计算含量得：L-LA 含量(μmol/g 质量）=1.1875×x÷W ×稀释倍数 = 1.1875 × 1.266 ÷ 0.1 × 5 =75.17μ mol/g 质量。
2、取 100μL 小鼠血清加入1mL 提取液，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二 ，离心取 上 清， 之 后 按 照 测 定 步 骤 操 作 ， 测得计算ΔA测定=A测定管-A对 照管 =1.152-0.407 =0.745，根据标准曲线 y =0.7826x+0.0215，x =0.924，按照液体体积计算含量得：L-LA 含量(μmol/mL) = 13.0625×x =13.0625 ×0.924 =12.07μmol/mL。
