L-乳酸(L-LA)含量检测试剂盒 ; 100T/48S
测定意义：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关 ，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。测定原理：乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使 NAD+还原生成 NADH 和 H +， H+传递给 PMS 生成的 PMSH2 还原 MTT 生成紫色物质 ，在 570nm 处有特征吸收峰。需要的仪器 ，耗材 ：天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体6 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体8mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体2mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二： 临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V） =10μL：450μL 的比例配制试剂二溶液，现用现配；
2、试剂四：临用前每瓶加入 3 mL 蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融 ， -20℃保存 4 周,
3、标准品 ：临用前加入 1.04 mL 蒸馏水配成 100μmol/mL 的标准溶液； 2-8℃保存 4 周。剂二： 临用前加入 0.8 mL 蒸馏水 ，充分溶解。用不完的试剂分装保存,-20℃可保存 4 周 ，避免反复冻融；
产品说明：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸 ， 同时使 NAD+还原生成 NADH 和 H+,H+传递给 PM
生成的 PMSH2还原 MTT 生成紫色物质 ，在 570nm 处有特征吸收峰。
技术指标：
低检出限 ：0.0771μmol/mL
线性范围 ：0.078-5μmol/mL
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品 ：
天平、研钵/匀浆器、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、 乙醇和蒸馏 水。
操作步骤：
一、样本处理
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g ，加入1mL 提取液一）加入提取 液一 ，冰浴匀浆后于 4℃ , 12000g 离心 10min ，取 0.8mL 上清液 ， 再缓慢加入 0.15mL 提取液二 ，缓慢吹打混匀至 无气泡产生 ，4℃ 12000g 离心10min 后取上清待测。
2. 细胞：按照细胞数量（10⁶个）：提取液一体积（ mL）为 5~10： 1 的比例（建议 5 × 10 ⁶个细胞加入 1mL 提取液一）， 冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒， 间隔 7 秒，总时间 3min）；于 4℃ , 12000g 离心 10min ，取 0.8mL 上清液 ，再缓慢加入 0.15mL 提取液二 ， 缓慢吹打混匀至无气泡产生 ， 4℃ 12000g 离心 10min 后取上清待测。
3. 血清（浆）等液体 ：取 100μL 液体加入 1mL 提取液一 ，4℃ 12000g 离心 10min ，取0.8mL 上清液，再缓慢加入 0.15mL 提取液二 ， 缓慢吹打混匀至无气泡产生,12000g 离心10min 后取上清待测。
注：提取液二需缓慢加入 ，加入后会产生大量气泡 ，建议使用 2mL EP 管进行操作。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，波长调至 570nm，分光光度计用乙醇调零。
2、标准液的稀释：将 100μmol/mL 的标准溶液用蒸馏水稀释为 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的标准溶液待测。
3、标准品稀释表：
序号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 标准溶液体积(µL) | 蒸馏水体积(µL) | 稀释后浓度(μmol/mL) |
1 | 100 | 50 | 450 | 10 |
2 | 10 | 100 | 300 | 2.5 |
3 | 2.5 | 200 | 200 | 1.25 |
4 | 1.25 | 200 | 200 | 0.625 |
5 | 0.625 | 200 | 200 | 0.3125 |
6 | 0.3125 | 200 | 100 | 0.15625 |
7 | 0.15625 | 200 | 100 | 0.078 |
备注：实验中每个标准管需50µL标准溶液。 |
4、在1.5mLEP 管/96孔板按下表步骤加样
| 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 |
样本(μL） | 10 | 10 | - | - |
标准液(μL） | - | - | 10 | - |
蒸馏水(μL） | - | 10 | - | 10 |
试剂一(μL） | 40 | 40 | 40 | 40 |
试剂二( μL） | 10 | - | 10 | 10 |
试剂四(μL） | 20 | 20 | 20 | 20 |
在EP 管中充分混匀，于37℃水浴准确反应 20min。 |
试剂五(μL） | 6 | 6 | 6 | 6 |
试剂三( μL） | 60 | 60 | 60 | 60 |
37℃避光反应 20min 后于 25℃ , 10000rpm 离心 10min ，去上清 ，留沉淀。 |
乙醇(μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
充分溶解沉淀后，于 570nm 处测定吸光值，分别记为 A 测定管，A对照管，A标准管，A空白管，计算ΔA测定=A 测定管-A对照管ΔA标准 =A标准管-A空白管。（标曲和空白管只需做1-2次） |
三、乳酸含量的计算
1、标准曲线的绘制
以各标准溶液浓度为 x 轴,以其对应的吸光值(ΔA标准)为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入公式中得到 x( μmol/mL）。
2、乳酸含量计算
(1) 按照蛋白含量计算
L-LA 含量(μmol/mg prot） =x×V 样本÷（V 样本 ×Cpr） =x÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
L-LA 含量(μmol/g 质量） =x×（V 上清+V 提取液二）÷（W ×V 上清÷V 提取液一）=1.1875×x÷W
(3) 按照细胞数量计算
L-LA 含量(μmol/10⁶cell) =x×（V 上清+V 提取液二)÷(N ×V上清÷V 提取液一） ÷N =1.1875×x÷N
(4) 按照液体体积计算
L-LA 含量(μmol/mL)=x×(V上清+V提取液二) ÷ [V 液体 × V 上清 ÷ (V 提取液一+V 液体) ] =13.0625×xV 样本： 加入的样本体积,0.05mL； W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度,mg/mL，蛋白浓度需自行测定；V 上清：提取时上清液体积， 0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体 积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积,1mL； N：细胞数量,以百万计；V液体 ：液体样本体积 ，0.1mL。
注意事项：
1、如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
2、提取液一中含有蛋白质沉淀剂,因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取样本。
实验实例：
1、取 0.1g 兔心加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心 , 取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二 ， 离心取上清后稀释 5 倍, 之后按照测定步骤操作, 使用 96 孔板测得计算 ΔA 测定 =A 测定管-A 对照管 =0.591-0.069 =0.522，根据标准曲线 y =0.412x-0.0214 ，x =1.319，按样本质量计算含量得：L-LA 含量(μmol/g 质量) = 1.1875×x÷W × 稀释倍数 =1.1875 × 1.319 ÷ 0.1 × 5 =78.32μ mol/g 质量。
2、取 100μL小鼠血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清, 之后按照测定步骤操作,使用96孔板测得计算ΔA测定 =A测定管-A对照管 =0.572-0.211 =0.361，根据标准曲线 y =0.412x-0.0214,x =0.928，按照液体体积计算含量得：L-LA 含量(μmol/mL) =13.0625×x =13.0625 ×0.928 =12.122μmol/mL。
