L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性检测试剂盒 ; 100T/48S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体7mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1mL ×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用时加入 1.3 mL 蒸馏水充分溶解备用 ，配好后可分装成小管-20℃保存，可保存 2 周,禁止反复冻融；
2、标准品：20μmol/mL 丙酮酸钠溶液。
产品说明：
L-LDH（ EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中 ，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与 L-乳酸之间的可逆反应，伴随着 NAD+/NADH 之间互变。 L-LDH 催化 NAD+氧化 L-乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与 2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。试验中所需的仪器和试剂 ：可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品 ：
可见分光光度计,恒温水浴锅,台式离心机,可调式移液器,1mL 玻璃比色皿,研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪,冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
1、细菌或培养细胞 ：先收集细菌或细胞到离心管内 ，离心后弃上清 ，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积(mL)为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次) ；8000g 4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。
2、组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织 ，加入 1mL 提取液）,进行冰浴匀浆。 8000g 4℃离心 10min ，取上清 ，置冰上待测。
3、血清(浆)样本 ：直接检测。 若有浑浊离心后取上清测定即可。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上 ，调节波长至 450nm ，分光光度计蒸馏水调零。
2、标准品的配制：将 20μmol/mL 标准品用蒸馏水稀释至 2、 1、0.5、0.25、0.125、0 μmol/mL，用2、1、0.5、0.25、0.125、0 μmol/mL 标准品做标准曲线。
3、标准品稀释可参考下表：
序号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 标准溶液体积(µL) | 蒸馏水体积(µL) | 稀释后浓度(μmol/mL) |
1 | 20 | 50 | 450 | 2 |
2 | 2 | 100 | 100 | 1 |
3 | 1 | 100 | 100 | 0.5 |
4 | 0.5 | 100 | 100 | 0.25 |
5 | 0.25 | 100 | 100 | 0.125 |
6 | - | - | 100 | 0 |
备注：下述实验中每个标准管需10µL标准品（注意不要在此步骤直接检测标准品吸光度）。 |
4、样本测定
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
样本 | 10 | 10 | - |
标准品 | - | - | 10 |
试剂一 | 50 | 50 | 50 |
试剂二 | 10 | - | |
蒸馏水 | - | 10 | 10 |
充分混匀， 37℃水浴 15min |
试剂三 | 50 | 50 | 50 |
充分混匀， 37℃水浴 15min |
试剂四 | 150 | 150 | 150 |
充分混匀, 常温静置,3min,取200μL转移至微量玻璃比色皿或在,96,孔板中,450nm 下测定吸光度， 记为,A 测定管,A 对照管,A 标准管。计算 ΔA =A 测定管-A 对照管。每个测定管需要设一个对照 ，标准曲线只需做1-2 次。 |
三、L-LDH活力单位计算
1、根据标准管的浓度（x, μmol/mL）和吸光度ΔA 标准（y,减去浓度为 0 的标准管吸光度）,建立标准曲线。根 据标准曲线 ，将ΔA（y ,ΔA）带入公式计算样本浓度（ x , μmol/mL）。
2、血清(浆)L-LDH 活力的计算
单位的定义：
每 mL 血清(浆)每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活性单位。
L-LDH活性(U/mL) = x×V 样÷V 样÷T × 10³ =66.7 ×x
3、细胞,细菌和组织中L-LDH 活力的计算
(1) 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义 ：
每 mg 组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙酮酸定义为一个酶活性单位。
L-LDH活性(U/mg prot) = x×V 样 ÷ (Cpr×V 样)÷T × 10³ =66.7 ×x÷Cpr
(2) 按样本质量计算：
单位的定义 ：
每 g 组织每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活性单位。
L-LDH 活性(U/g 质量) = x×V 样 ÷ (W÷V 样总 ×V 样)÷T×10³=66.67×x÷W
(3) 按细菌或细胞计算：
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活性单位。
L-LDH 活性(U/10⁴cell) = x×V 样 ÷ (N÷V 样总 ×V 样)÷T×10³=66.7 ×x÷NV 样 ：反应体系中加入的样本体积,10μL =0.01mL；V样总：加入 的提取液体积 T： 反应时间,15min；Cpr：蛋白质浓度,mg/mL；W：样本质量,g；N：细胞或细菌总数,以万计;10³ ;单位换算系数,1μmol/mL= 10³nmol/mL。
注意事项：
1、ΔA大于1.3 或者小于0.01 时，建议将样本用蒸馏水稀释或者增大样本量进行实验 ，注意同步修改计算公式。
实验实例：
1、称取 0.103g 景天叶片， 加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆,8000g，4℃离心10min ，取上清置冰上待测。之后按 照测定步骤操作 ，用 96 孔板测得计算ΔA =A 测定管-A 对照管=0.275-0.199 =0.076，带入标曲 y =0.5218x+0.0063,R2 =0.9983，得 x =0.134 µmol/mL，计算乳酸脱氢酶活性得：L-LDH(U/g 质量)=66.67×x÷W =86.74 U/g
2、称取 0.109 g 兔肝，加入1mL 提取液 ，进行冰浴匀浆 ，8000g ，4℃离心 10min ，取上清用蒸馏水稀释 80 倍后置冰 上待测。之后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算ΔA =A测定管-A 对照管 =0.795-0.132 =0.663 ，带入标曲 y =0.5218x+0.0063 ， R2 =0.9983，得x =1.259 µmol/mL，计算乳酸脱氢酶活性得：L-LDH(U/g质量)=66.67×x÷W×稀释倍数=61605.53 U/g
3、取10μL 马血清之后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算ΔA =A 测定管-A对照管=0.415-0.161 =0.254，带入标曲 y =0.5218x+0.0063 ，R⒉=0.9983，得 x =0.475 µmol/mL，计算乳酸脱氢酶活性得：L-LDH(U/mL) =66.67×x =31.67U/mL
