乙酰胆碱酯酶(A-CHE)检测试剂盒 ; 50管/24样
测定原理:
乙酰胆碱酯酶(Acetyl choline esterase)水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸,胆碱可以与巯基显色剂反应生成 TNB (对称三硝基苯,Sym-Trinitrobenzene)黄色化合物,根据颜色深浅进行比色定量,水解产物胆碱的数量可反应胆碱酯酶的活力。
试剂组成及配制:
试剂一:标准品,粉剂×3支,4℃保存 6个月。 1mol/ml
标准品应用液配制:取标准品一支加生理盐水10ml混匀,现用现配。
试剂二:底物,粉剂×2支,4℃保存 6个月。
底物缓冲液配制:用时每支粉剂加生理盐水 20ml,制备成底物缓冲液,4℃保存两周。
试剂三:显色剂贮备液,3ml×1支,4℃保存 6个月。
显色应用液配制:用时按照显色剂贮备液:生理盐水=1︰9稀释,配成显色应用液。按需配制,也可一次配制30ml,避光冷藏3个月。
试剂四:抑制剂,液体 2ml ×1支。打开后装在空的小塑料瓶内(附空瓶一只),室温保存6个月。
试剂五:透明剂,液体6ml×1支,室温保存6个月。天冷时会有沉淀或混浊,须在37℃水浴加热至透明后方可使用。
生理盐水:60ml×2瓶,室温保存6个月。
操作过程:
1、样品前处理:
组织样本:准确称取组织重量,按重量(g):体积(ml)=1:9的比例,加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件下机械匀浆,2500 转/分,离心10分钟,取上清液待测(同时取部分上清测定蛋白浓度,蛋白定量试剂盒本所有售)。
血清(浆):取不抗凝或抗凝全血 1000~1500转/分,离心8分钟,取上层血清(浆)。一般测定时将血清或血浆用生理盐水1︰ 9稀释(具体稀释浓度以预实验结果为准)。
全血样本:取0.1ml抗凝全血加双蒸水至10ml,即按1︰ 99 稀释,充分混匀。如果您的样本量很少,可以减少取样量。例如取0.01ml或 0.02ml抗凝全血加双蒸水至1ml或2ml。取a ml(一般为0.1ml)进行检测,每个样本取样前必须充分混匀。
操作过程:
| 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本(ml) | a * | | | |
1mol/ml标准品应用液(ml) | | a * | | |
双蒸水(ml) | | | | a * |
底物缓冲液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
显色应用液(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
混匀,37ºC 准确反应 6 分钟 |
抑制剂(ml) | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
透明剂(ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
样本(ml) | | a * | | |
混匀,静置15分钟,波长412nm,0.5cm光径,双蒸水调零,测各管吸光度OD值。 |
注:a*所表示所取的样品量、标准品量、双蒸水的量,三者均相等:
①、血清(浆)测试前用生理盐水10倍稀释,参考取样量为 30~50l。
②、10%脑组织匀浆的参考取样量为30~50l。
③、1:99稀释后的全血稀释液取0.1ml,取样前每只要摇匀。
公式及举例:
(一)、组织匀浆中乙酰胆碱酯酶的计算:
1、单位定义:
每毫克组织蛋白在37ºC保温6分钟,水解反应体系中1mol基质为1个活力单位。
2、计算公式:
(二)、血清中乙酰胆碱酯酶的计算:
1、单位定义:
每毫升血清样本在37ºC保温6分钟,水解反应体系中1mol基质为1个活力单位。
2、计算公式:
(三)、全血中乙酰胆碱酯酶的计算:
1、单位定义:
每毫升全血在 37℃保温6分钟,水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位。
2、计算公式: