α-淀粉酶活性检测试剂盒 ; 50T/24S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体10mL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂× 1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一： 临用前加入 12.5mL 试剂三 ，置于常温水中并加热至煮沸 ，期间不断搅拌粉剂至溶解 ，用不完的 试剂 2-8℃保存 8 周；
2、标准品：10mg 淀粉标准品。临用前加10 mL试剂三,置沸水浴中振荡溶解,配成1mg/mL淀粉标准液,2- 8℃保存四周。
产品简介：
淀粉酶负责水解淀粉,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。
α-淀粉酶催化淀粉分子中的α-1,4 糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖以及糊精等,碘可以与未被水解的淀粉结合 ， 生成在 570nm 下有特征吸收峰的复合物 ，其深浅可计算出淀粉酶的活力单位。α-AL 耐热 ，但是β-淀粉酶可在70℃ 钝化 15min。因此粗酶液经过 70℃钝化15min ，就只有α-AL 能够催化淀粉水解。
ydolyzed starch+odin e——Blue complex(570nm)
注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿,研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理
1、组织：称取约 0.1g 样本，加 1mL 蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取 15min，每隔 5min 振荡1次，使 其充分提取；6000g ，室温离心10min，吸取上清液即为淀粉酶原液。
2、液体：直接检测。（若有浑浊则离心后进行测定）
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至 570nm ，蒸馏水调零。
2、将淀粉标准液用蒸馏水稀释为 0.2、 0.1、0.05、0.025、0.0125、 0.00625、 0.003125、0.0015625mg/mL的标准溶液。
序号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 标准溶液体积(µL) | 蒸馏水体积(µL) | 稀释后浓度(μmol/mL) |
1 | 1 | 200 | 800 | 0.2 |
2 | 0.2 | 500 | 500 | 0.1 |
3 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
4 | 500 | 500 | 500 | 0.025 |
5 | 0.025 | 500 | 500 | 0.125 |
6 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
7 | 0.00625 | 500 | 500 | 0.003125 |
8 | 0.003125 | 500 | 500 | 0.0015625 |
实验中每个标准管需250µL标准溶液。 |
3、按操作表依次加入各试剂：
试剂(µL) | 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 | 标准空白管 |
α-淀粉酶原液 | 250 | 250 | - | - | - |
蒸馏水 | - | - | 250 | - | 250 |
标准溶液 | - | - | - | 250 | - |
70℃水浴15min 左右 ，冷却 |
试剂一 | 250 | - | 250 | - | - |
蒸馏水 | - | 250 | - | 250 | 250 |
在 40℃恒温水浴中准确保温 10min |
试剂二 | 125 | 125 | 125 | 125 | 125 |
蒸馏水 | 375 | 375 | 375 | 375 | 375 |
混匀后于570nm 处读取测定管、对照管、空白管、标准管、标准空白管吸光度， 分别记为 A 测定、A对照、A空白、A标准和A标准空白，计算 ΔA 测定 =A 空白-（A 测定-A 对照），ΔA 标准 =A 标准-A标准空白。空白管 和标准曲线只需做1-2次。 |
三、u-淀粉酶活性计算
1、标准曲线的绘制：
根据标准管的浓度(x ,mg/mL)和吸光度ΔA标准（y ,ΔA标准)，建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA 测定（y ,ΔA测定）带入公式计算样本浓度(x,mg/mL)。
2、α-淀粉酶活性的计算：
(1) 按照样本质量计算
单位定义 ：
每g组织每分钟消耗 1mg 淀粉定义为 1个酶活力单位。
Α-淀粉酶活性(U/g 质量) =x×V 样÷ (W ×V 样÷V 样总)÷T =0.1 ×x÷W
(2) 按照蛋白质浓度计算
单位定义：
每mg组织蛋白每分钟消耗 1mg 淀粉定义为1个酶活性单位。
α-淀粉酶活性(U/mg prot) =x×V 样÷(V 样×Cpr)÷T =0.1 ×x÷Cpr
(3) 按照液体体积计算
单位定义：
每mL 液体每分钟消耗 1mg淀粉定义为 1个酶活性单位。
Α-淀粉酶活性 (U/mL) =x×V 样÷V 样÷T =0.1 ×xV 样：加入反应体系中样本体积,0.25mL；V 样总：样本总体积, 1mL；Cpr：样本蛋白质浓 度,mg/mL；W：样本质量,g；T：反应时间, 10min。
注意事项：
吸光值大于 1.2 或者ΔA 大于0.8 时 ，可以对样本进行适当稀释后测定。
实验实例：
取约 0.1g 藜叶片， 加1mL 蒸馏水匀浆,匀浆后在室温下放置提取 15min，每隔 5min振荡1次 ，使其充分提取；6000g ，室温离心10min，吸取上清液，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA 测定 =A 空白-(A 测定-A 对照) =0.915-(0.703-0.176) =0.388 ，带入标准曲线 y =2.1736x+0.0057，计算 x =0.176 ，按样本质量计算酶活得：α-淀粉酶活性(U/g 质量) =0.1 ×x÷W =0.176 U/g 质量。
