苯胺-4羟化酶(AH)活性检测试剂盒 ; 100管/48样
测定意义：
细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH 在 P450 酶系中相当于 CYP2E1 亚型，CYP2E1 不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。
测定原理：
AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在 630nm 处有特征吸收峰；通过测定630nm 吸光度增加速率，来计算 AH 活性。
自备的仪器和用品 ：
普通离心机、超速离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、双蒸水和冰。
试剂盒组成和配制：
试剂一：粉剂× 1 瓶，4℃保存。临用前加入 100mL 蒸馏水，充分溶解。
试剂二：液体× 1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂× 1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，充分溶解。
试剂四：粉剂× 1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水，充分溶解。
试剂五：液体× 1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂× 1 瓶（腐蚀性试剂），4℃避光保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，充分溶解。
试剂七：粉剂× 1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水充分溶解。
标准液：液体× 1 瓶，10 μmol/L ，4℃避光保存。
溶液的配制：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃,离心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体： 100 000g 4℃, 离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。
测定操作：
1、分光光度计/酶标仪预热 30 min ，调节波长到 630 nm，蒸馏水调零。
2、试剂三置于 37℃水浴中预热 30min。
3、试剂五置于冰浴预冷 30min。
4、标准管：取 0.5 mL EP 管，加入 100μL 标准液，100μL 试剂六，100μL 试剂七，混匀后室温静置 30min，吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为 A 标准管。
5、对照管：取 0.5 mL EP 管，加入 50μL 粗酶液，100μL 试剂三，50μL 蒸馏水，混匀后 37℃水浴中保温30min；再加入 100μL 试剂五，混匀后冰浴 5min ，11000rpm ，4℃, 离心 10min；取 100μL 上清液，加入新的 0.5 mL EP 管；再加入 100μL 试剂六，100μL 试剂七，混匀后室温静置 30min ，吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为 A 对照管。
6、测定管：取 0.5 mL EP 管，加入 50μL 粗酶液，100μL 试剂三，50μL 试剂四，混匀后 37℃水浴中保温30min；再加入 100μL 试剂五，混匀后冰浴 5min ，11000rpm ，4℃, 离心 10min；取 100μL 上清液，加入新的 0.5 mL EP 管；再加入 100μL 试剂六，100μL 试剂七，混匀后室温静置 30min ，吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为 A 测定管。
AH活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管 ÷A 标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T= 2×（A测定管－A对照 管)÷A 标准管÷Cpr。
(2) 按样本质量计算
活性单位定义：
37℃中每克样本每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/g鲜重)= C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管) ÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T= 2×（A 测定管－A 对照管)÷A 标准管÷WC标准品：10μmol/L ；V 标准品：100μL=1 × 10-4L；稀释倍数：V 反总÷V上清液=300μL÷100μL=30Cpr：粗酶液蛋白质浓度 (mg/mL)，需要另外测定， 建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应 体系中粗酶液体积,50μL=0.05 mL； T：催化反应时间（min）,30min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T= 2×（A测定管－A 对照 管)÷A 标准管÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义：
37℃中每克样本每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/g鲜重) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T= 2×（A测定管－A 对照管）÷ A标准管÷WC 标准品：10μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-4L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=300μL÷100μL=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度 （mg/mL）,需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂 盒； W ：样品质量； V 样：加入反应体系中粗酶液体积,50μL=0.05mL; T：催化反应时间（min）,30min。
