吡哆醛含量检测试剂盒 ; 50T/48S

吡哆醛含量检测试剂盒 ; 50T/48S

测定意义： 

吡哆醛（pyridoxal ,PL）是维生素B6的组成成分之一 ，是氧化吡哆醇所得到的醛 ，广泛存在于肉类、谷类、蔬菜及坚果中。 吡哆醛在生物体内主要的活性辅酶形式是磷酸吡哆醛（ PLP），是 转氨酶、脱羧酶、消旋酶等多种酶的辅酶。

吡哆醛在一定条件的光激发下具有荧光效果，可以利用高效液相色谱法荧光检测器测定其含量。荧光检测器灵敏度较高 ，常用于痕量分析。

测定原理：

AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在 630nm 处有特征吸收峰；通过测定630nm 吸光度增加速率，来计算 AH 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

高效液相色谱仪（ Polaris C18-A 色谱柱（4.6  ×250 mm），荧光检测器（ FLD））、台式离心机、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管（1.5 mL）、针头式过滤器（水系）、注射器、抽滤器、滤膜 （水系、有机系）、棕色进样瓶、超纯水、 甲醇（色谱纯）。

试剂盒组成和配制：

提取液 ：液体30 mL ×1瓶 ，4℃保存；本提取液中含有不溶物 ，需摇匀后使用。

试剂一：液体5mL ×1瓶 ，4℃保存。

试剂二：液体1.5 mL × 1瓶, 4℃保存。

试剂三：粉剂×2 瓶 ，4℃保存。

标准品：粉剂 ×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入  0.821 mL  蒸馏水配制成 5 mg/mL    吡哆醛标准 溶液 ，4℃密封保存，避免阳光直射。

实验前准备工作：

1、瓶试剂三溶解到 1000mL 超纯水中，再加入 0.55 mL  的试剂二，混匀，得到流动相A。

2、将 1000 mL 配制好的流动相A、甲醇（色谱纯）用滤膜抽滤。（配制好的流动相 A 采用 0.22 µm 水系滤膜抽滤，甲醇采用 0.45µm 有机系滤膜抽滤）。

3、将抽滤好的流动相超声 20 min，除去气泡。

4、标准品的配制：将5mg/mL的吡哆醛标准溶液采用倍比稀释的方法分别用蒸馏水稀释成16000ng/mL、3200 ng/mL、640 ng/mL、128 ng/mL、25.6 ng/mL的吡哆醛标准溶液。（标准品浓度 仅供参考 ，可根据实际样品浓度进行调整）。4℃避光保存（密封)，测试前采用水系针头式过滤 器过滤到棕色进样瓶内，待测。

操作步骤：

一、吡哆醛的提取：

组织样本：按质量（g) :提取液体积(mL)1:5~ 10比例，建议称取  0. 1g样本（新鲜样本：剪 碎；烘干样本 ：研磨过筛），加入 0.6 mL 提取液（新鲜样本需匀浆），密封 ，混合均匀 ，置于60℃水浴锅中浸取30 min。冷却至室温 ，加入 0. 1 mL 试剂一 ，0.3 mL蒸馏水，混匀，静置2 min。10000rpm 离心10 min，取上清液（若仍有浑浊 ，可再次离心），测试前采用水系针头式过滤器过滤到棕 色进样瓶内，待测（若上清液颜色过深或者浓度过高 ，可稀释后再次过滤待测）。

细胞 ：按细胞数量（10⁴):提取液体积（ mL） 1000 ~5000 万:1比例，建议取 5000万细胞，加入0.6 mL提取液，超声破碎细胞（功率 20%，超声3s，间歇9s，重复30次，总时间 ：6 min），密封混匀 ，置于60℃水浴锅中浸取30 min。冷却至室温，加入0. 1mL 试剂一 ，0.3 mL 蒸馏水，混匀， 静置2 min。10000 rpm离心  10 min  ，取上清液（若仍有浑浊，可再次离心），测试前采用水系针头 式过滤器过滤到棕色进样瓶内，待测。

血清 ：按血清体积（ mL）:提取液体积(mL)1~5:1比例，建议取0.5 mL血清，加入 0. 1 mL 提 取液，密封混匀，置于 60℃水浴锅中浸取30 min 。冷却至室温，加入 0. 1 mL试剂一，0.3 mL蒸馏水，混匀，静置2 min。10000 rpm 离心10 min，取上清液（若仍有浑浊，可再次离心)，测试前采 用水系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内，待测。

二、测定步骤：

1、开启电脑、打开液相色谱仪各模块开关按钮，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量为10 µL，柱温：30℃, 流速为1mL/min，荧光检测器： Ex =293 mn  ， Em=395 nm。单个样本走样时间10 mi，设置完毕保存方法组。

2、采用相应的流动相清洗柱子，用流动相A平衡柱子，待基线稳定后开始加样。

3、检测待测的标准品溶液，进样量为10 µL，在10 min内可分离出吡哆醛，吡哆醛的保留时间为6.3 min 左右（体系、柱子、流动相pH、温度等不同，保留时间有差异，仅作为参考）。

4、检测待测的样品溶液，进样量为 10 µL,在相应的保留时间处检测吡哆醛的峰面积。

5、序列完整加样表：（包含单个样本测定完成后色谱柱的清洗和再平衡过程）

三、吡哆醛含量计算

       以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制吡哆醛的标准曲线，将样本的峰面积代入标准曲线 ，计算提取液中吡哆醛的浓度                       x(ng/mL)。

1、组织样本

      吡哆醛的含量(µg/g)= x×V 提取÷W ×F÷1000 =0.001x÷W × F

      V提取 ：加入提取液总体积,1mL；W：样本质量，g；F：样本稀释倍数（稀释后测试的样本，计算时需要乘以相应的稀释倍数）；1000：单位转          化系数,1 μg = 1000ng。

2、细胞样本

      吡哆醛的含量(µg/10⁴细胞= x  ×V 提取÷细胞数量(10⁴ )× F÷ 1000 =0.001x÷细胞数量（10⁴) ×  FV 提取：加入提取液总体积 ，1 mL（0.6mL        提取液+0. 1mL 试剂一+0.3mL 蒸馏水）；细胞数量：单位10⁴；F：样本稀释倍数（稀释后测试的样本 ，计算时需要乘以相应的稀释倍                      数）;1000：单位 转化系数，1μg = 1000ng。吡哆醛的含量(µg/mL)= x×V

3、血清样本

     提取÷V 样本×F÷1000 =0.002x×FV 提取：提取液总体积，1 mL（0.5mL血清+0. 1mL提取液+0. 1mL 试剂一+0.3mL 蒸馏水）；V样本：加入         样本体积 ，0.5 mL；F：样本稀释倍数（稀释后测试的样本，计算时需要乘以相应的稀释 倍数）；1000：单位转化系数,1μg =1000ng。

注意事项：

1、本试剂盒的提取液中含有不溶物，需摇匀后使用。

2、测试完毕后 ，需要用高浓度的超纯水相冲洗色谱柱(约 20-30 个柱体积），以防阻塞色谱柱，再用高浓度的有机相冲洗色谱柱 ，按柱子的种类规范冲洗，防止损伤色谱柱。

3、标准品的稀释倍数要根据样品中吡哆醛的浓度确定 ，样品中吡哆醛的峰面积必须在不同浓度的标 准品溶液的峰面积之内 ，该标准品的稀释倍数只是一个参考。若样本中吡哆醛浓度过高，建议用蒸 馏水稀释后再测。

4、若样本量过大，建议每天测试一次标准溶液(一个浓度的标准溶液即可），以确定相应的保留时间，待测溶液测试前须放置至室温状态。