蛋白质二硫键含量检测试剂盒 ; 50T/24S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体40mL ×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体40mL ×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体120mL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体6mL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体1.2mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
粉剂一 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、提取液配制： 临用前根据样本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL 进行配制 ，勿一次性全部混合。
2、若试剂二有析出，可置于37℃水浴加热至澄清透明后使用。
3、标准品： 10mg 还原型谷胱甘肽（ GSH）临用前加入1.3mL蒸馏水配制成 25μ mol/mL，2-8℃保存4 周。
4、0.125μmol/mL 标准品配制 ：取50μL 25μmol/mL标准品，加入950μL蒸馏水，充分混匀，配制成1.25μmol/mL的标准品；然后取 100μL1.25μmol/mL 标准品 ，加入900μL蒸馏水,充分混匀,配制成0.125μmol/mL 的标准品使用 ，现配现用。
产品简介：
蛋白质是一类重要的生物大分子，存在于一切生物体内，是生命的基础物质。
二硫键是连接不同肽链或同一肽链中，两个不同半胱氨酸残基的巯基的化学键。二硫键对蛋白质的结构影响很大，在蛋白质分子中，起着稳定肽链空间结构的作用，所以测定蛋白质二硫键含量尤为重要。还原剂会使二硫键裂解，裂解后的巯基会发生亲核反应，即巯基与 5,5, -二硫代-双-硝基苯甲酸（ DTNB）反应，生成黄色化合物，在 412nm 处有最大吸收峰 ，据此可以计算蛋白质二硫键含量。
注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、天平、低温离心机、研钵/匀浆器、丙酮（AR）、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
1、组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液,冰浴匀浆后于4℃, 3000rpm离心10min，弃上清。在沉淀中加入 2mL 试剂一 ，搅匀后溶解沉淀 ，沉淀溶解液 作为样本进行实验。（注：（1）植物叶片等纤维含量较高的样本， 溶解沉淀后 4℃ 3000rpm 离心 3min ，取上清 作为样本进行实验,；(2）加入试剂一后会有大量气泡产生，请缓慢加入，建议使用 5mL 的 EP管)。
2、细菌/细胞： 按照细菌/细胞数量（10⁶个）：提取液体积（ mL）为 5~10：1 的比例（建议 5 百万细菌/细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3 秒,间隔10 秒,总时间 3min）后，于 4℃ , 3000rpm 离心10min， 弃上清。在沉淀中加入 2mL试剂一 ，搅匀后溶解沉淀 ，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注：（1）若沉淀溶解不完全，可 4℃3000rpm 离心3min，取上清作为样本进行实验；(2)加入试剂一后会有大量气泡产生 , 请缓慢加入，建议使用5mL的EP管）。
3、血清/血浆、牛奶等液体 ：取100μL 液体样本加入0.9mL 丙酮，4℃ , 3000rpm离心10min ，弃上清。在沉淀中加入 2mL 试剂一，搅匀后溶解沉淀，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注： 若测定数值偏小 ， 可改变样本与丙 酮的比例 ， 如取 0.2mL 液体样本加入0.8mL 丙酮或 0.3mL 液体样本加入 0.7mL 丙酮，注意同步修改计算公式）。
二、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至412nm ,分光光度计蒸馏水调零。
2、操作表：(建议在2mL的EP管中操作）
试剂名称(mL） | 对照管 | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
样本 | 0.5 | 0.5 | - | - |
蒸馏水 | - | - | - | - |
标准品 | - | - | 0.5 | 0.5 |
粉剂一 | - | 5mg | - | - |
开盖反应30min，期间每隔10min用吸头吹打至气泡不再产生，禁止扣盖反应 | |
提取液 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
试剂二 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
充分混匀 ，4℃ 3000rpm 离心 10min 后取上清于 1.5mL EP 管中 | |
上清液 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 |
试剂三 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
充分混匀 ，测定 412nm 下的吸光度 ，分别记为 A1 对照、 A1 测定。 | |
试剂四 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
充分混匀，室温静置 10min 后测定 412nm 下的吸光度，分别记为 A2 对照、 A2 测定、 A 空白、A 标准。计算 ΔA 测定=（A2 测定-A1 测定）-（A2 对照-A1 对照），ΔA 标准=A 标准-A 空白。空白管和标准管只需测1-2次。 每个测定管需设一个对照管。注：第一步测定 412nm 吸光度时， 可将反应液全部倒入1mL玻璃比色皿中测定,之后可直接在比色皿中 加入试剂四混匀后继续测定。 |
三、白蛋白含量计算
1、按样本蛋白浓度计算
白蛋白含量(mg/mg prot)= ΔA 测定 ×(C 标÷ΔA 标准) ×V 样÷(V 样 ×Cpr)=5×ΔA测定÷ΔA 标准÷Cpr
2、按样本质量计算
白蛋白含量(mg/g 质量)= ΔA 测定 ×(C 标÷ΔA 标准)×V 样÷（W ×V 样÷V 样总)=5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W
3、按细菌/细胞数量计算
白蛋白含量（ mg/10⁶cell)=ΔA 测定×（ C 标÷ΔA 标准） ×V 样÷（V 样× N÷V 样总)=5×ΔA 测定÷ΔA 标准÷N
4、按液体体积计算
白蛋白含量(mg/mL)= ΔA 测定 × (C 标÷ΔA 标准)×V 样÷V 样 = 5 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 C 标： 标准管浓度,5 mg/mL；V 样：加入样本体积， 0.02mL；V 样总： 加入提取液体积， 1mL；Cpr：样本蛋 白质浓度,mg/mL；W：样本质量,g； N：细菌/细胞总数 ，以 10⁶计。
注意事项：
1、如果ΔA 测定小于 0.010 或测定管吸光值接近空白管 ，可以增加样本量后再进行测定；如果ΔA 测定大于 0.5,建议将样本上清用提取液适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。
2、如果样本加入显色剂后出现浑浊 ，建议将样本上清用提取液适当稀释后再进行测定注意同步修改计算公式。
实验实例：
取20μL人血清样本，用提取液稀释10倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算 ： ΔA测定=A测定-空白=0.426-0.124 =0.302,ΔA标准=A标准-A空白=0.406-0.124 =0.282，按液体体积计算得：白蛋白含量(mg/mL) =5 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 ×10(稀释倍数)=53.546 mg/mL。
