蛋白质游离巯基含量检测试剂盒 ; 50T/24S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体25mL ×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体25mL ×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体60mL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体17mL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体2mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、提取液配制 ：临用前根据样本量按照提取液一：提取液二 =1mL： 1 mL 进行配制 ， 请勿一次性全部混合。
2、若试剂二有析出 ，可置于 37℃水浴加热至澄清透明后使用。
3、标准品：10mg 还原型谷胱甘肽（GSH）。临用前加入 1.3mL 蒸馏水配制成 25μmol/mL ，2-8℃保存 4 周。
4、0.125μmol/mL 标准品配制：取 50μL 25μmol/mL 标准品，加入 950μL 蒸馏水，充分混匀 ，配制成 1.25μmol/mL的标准品；然后取 100μL 1.25μmol/mL 标准品，加入900μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.125μmol/mL的标准品备用，现配现用。
产品简介：
巯基的存在使得蛋白质能够进行二硫键的形成 ，从而维持分子的稳定性和功能性。此外，巯基还参与到氧化还原反应中，具有重要的生物学作用。在细胞内，巯基含量的变化与多种疾病的发生和进展密切相关，因此巯基也成为了生物医学领域中的重要研究对象。
本试剂盒测定的是蛋白质中的游离巯基含量。一定条件下巯基会发生亲核反应 ，即巯基与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB）反应，生成黄色化合物 ，在412nm处有最大吸收峰 ，据此可以计算蛋白质游离巯基含量。
-SH-DNB——NB(4I2am)
注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、低温离心机、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、丙酮（AR）、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
1、组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃ , 3000rpm 离心 10min ，弃上清。在沉淀中加入 2mL 试剂一 ，搅匀后溶解沉淀 ，沉淀溶解液 作为样本进行实验。注：
(1) 植物叶片等纤维含量较高的样本，溶解沉淀后 4℃ 3000rpm离心3min ，取上清 作为样本进行实验,；
(2) 加入试剂一后会有大量气泡产生，请缓慢加入，建议使用5mL的EP管）。
2、按照细菌/细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为 5~10：1 的比例（建议5百万细菌/细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3 秒，间隔10 秒 ， 总时间3min）后，于 4℃ , 3000rpm离心10min，弃上清。在沉淀中加入2mL试剂一 ，搅匀后溶解沉淀 ，沉淀溶解液作为样本进行实验。
注：
(1) 若沉淀溶解 不完全，可 4℃ 3000rpm 离心 3min ，取上清作为样本进行实验；(2) 加入试剂一后会有大量气泡产生，请缓 慢加入， 建议使用5mL的EP管）。
3、血清/血浆、牛奶等液：取 100μL 液体样本加入 0.9mL 丙酮 ，4℃ , 3000rpm 离心10min ，弃上清。在沉淀中加入2mL 试剂一 ，搅匀后溶解沉淀 ，沉淀溶解液作为样本进行实验。
注：若测定数值偏小， 可改变样本与丙 酮的比例， 如取0.2mL液体样本加入0.8mL丙酮或0.3mL液体样本加入0.7mL丙酮，注意同步修改计算公式）。
二、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至412nm ,蒸馏水调零。
2、操作表：(建议在5mL的EP管中操作）
试剂名称(mL） | 对照管 | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
样本 | 0.5 | 0.5 | - | - |
蒸馏水 | - | - | 0.5 | - |
标准品 | - | | - | 0.5 |
提取液 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
请缓慢加入提取液混匀,并用吸头反复吹打至气泡不再产生(期间会有大量气泡产生,开盖放置） | - |
提取液 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
请缓慢加入提取液混匀,并用吸头反复吹打至气泡不再产生(期间会有大量气泡产生,开盖放置） | - |
提取液 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
请缓慢加入提取液混匀,并用吸头反复吹打至气泡不再产生(期间会有大量气泡产生,开盖放置） | - |
试剂二 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
充分混匀 ，4℃ 3000rpm 离心 10min 后取上清于 1.5mL EP管中 | - |
上清液 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 |
试剂三 | 0.3 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
试剂四 | - | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
充分混匀，室温静置 10min 后， 测定 412nm 下的吸光度分别记为 A 对照、A 测定、A 空白、A 标准。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。空白管和标准管只需测 1-2 次。每个测定管需设一个对照管。 |
三、蛋白质二硫键含量的计算
1、按样本蛋白浓度计算
蛋白质游离巯基含量(μmol/mg prot）=ΔA 测定÷ (ΔA 标准÷C 标准）×V 样本÷(V 样本 × Cpr)× F =0.125 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 ×Cpr×F
2、按样本质量计算
蛋白质游离巯基含量(μmol/g 质量)=ΔA 测定÷ (ΔA 标准÷C 标准)×V 试剂一÷W × F=0.25 ×ΔA测定÷ΔA 标准÷W× F
3、按照液体体积计算
蛋白质游离巯基含量(μmol/mL)=ΔA 测定÷ (ΔA 标准÷C 标准)×V 试剂一÷V 液样 × F =2.5 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 × F
4、按照细胞/细菌数量计算：
蛋白质游离巯基含量(μmol/10⁶cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ×V 试剂一÷N×F = 0.25×ΔA测定÷ΔA 标准÷N×FC标准 ：标准管浓度， 0.125μmol/mL；V 样本：加入的样本体积 ，0.5mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；W：样本质量，g；V 试剂一： 提取时加入试剂一体积，2mL；V液样 ：提取时加入的样本体 积 ，0.1mL；F：稀释倍数。N：细胞/细菌总数，以10⁶计。
注意事项：
1、若样本ΔA 测定<0.01,可适当增大样本量后测定，注意同步修改空白管和标准管及计算公式；若样本ΔA 测定 >1.5,可用试剂一稀释沉淀溶解液后测定 ，注意同步修改计算公式中的稀释倍数。
2、可使用BCA法测定蛋白浓度。
实验实例：
1、取100μL马血清，按照测定步骤操作，用 1mL 玻璃比色皿测得ΔA测定=A测定-A 对照=0.110-0.021 =0.089，ΔA 标准 =A 标准-A空白=0.633-0.076 =0.557，按样本液体体积计算蛋白质游离巯基含量得：蛋白质游离巯基含量(μmol/mL)=2.5 ×ΔA 测定÷ΔA 标准 × F =0.399μmol/mL。
2、取 0.1036g 鼠肝，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得ΔA测定 =A 测定-A 对照 =0.339-0.095 =0.244，ΔA 标准 =A 标准-A 空白 =0.633-0.076 =0.557 ,按样本质量计算蛋白质游离巯基含量得：蛋白质游离巯基含量(μmol/g 质量)=0.25 ×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W × F =1.057μmol/g质量。
3、取 0.1078g 黄豆粉，沉淀溶解液用试剂一稀释2倍后，按照测定步骤操作， 用 1mL玻璃比色皿测得 ΔA测定=A 测定-A 对照 =0.108-0.033 =0.075，ΔA标准=A 标准-A 空白=0.633-0.076 =0.557，按样本质量计算蛋白质游离巯基含量得：蛋白质游离巯基含量(μmol/g 质量)=0.25 ×ΔA 测定÷ΔA标准÷W× F=0.625μmol/g质量。
