N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)检测试剂盒 ; 50管/24样

N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)检测试剂盒 ; 50管/24样

测定意义： 

NAG 是溶酶体中的一种酸性水解酶，广泛存在于各种组织、体液和细胞中，以前列腺和肾近曲小管细胞内含量最高。NAG 活性变化与机体某些病理状态密切相关。

测定原理： 

NAG 分解 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 NAG 活性。

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体 50mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积(mL)为 500~1000 :1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20％或 200W ，超声3s ，间隔 10s ，重复30次)；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

NAG活性计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下：

      测定的回归方程为y=0.00543x+0.0083 ；x为标准品浓度(nmol/mL)，y为吸光值。

2、血清(浆)NAG 活力的计算：

      单位的定义：

      每mL血清(浆)每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

      NAG 活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083)÷0.00543×V反总]÷V样÷T =61.39×(ΔA-0.0083)

3、细胞、细菌和组织中NAG活力的计算：

(1) 按样本蛋白浓度计算

      单位的定义：

      每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

      NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083)÷0.00543×V 反总]÷(V样×Cpr)÷T=61.39×(ΔA-0.0083)÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

      单位的定义：

      每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

      NAG 活性(nmol/min/g鲜重)= [(ΔA-0.0083)÷0.00543×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=61.39×(ΔA-0.0083)÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

      单位的定义：

      每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

      NAG 活性(nmol/min /10⁴cell) =[(ΔA-0.0083)÷0.00543×V反总]÷(500×V样÷V 样总)÷T=0.123×(ΔA-0.0083)V 反总：反应体系

      总体积，0.5mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

      W：样本质量，g； 500 ：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。