滤纸酶检测试剂盒 ; 100T/48S
测定意义：
纤维素酶是由微生物产生的多组分的酶系，能水解纤维素 β-1,4 葡萄糖苷键生成葡萄糖，研究滤纸酶活力对纤维素酶的研究具有非常重要的意义。
测定原理：
滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在 540nm 处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算得滤纸酶的活力。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 25mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体 40mL×1瓶，4℃保存；
滤纸条：50mg×50条。
酶液提取：
1、组织：按照质量（g）：蒸馏水体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g ，加入1mL蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于 4℃, 12000rpm离心10min，取上清置于冰上待测。
2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：蒸馏水体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃ , 12000rpm离心 10min，取上清置于冰上待测。
3、培养液或其它液体：直接检测。
测定操作：
1、根据样本数量取两倍数量的滤纸条和Ep管，每支Ep管中放入一个卷状滤纸条（注意要放入底部），作为底物。
2、对照管：取200μL灭活的酶液，加入500μL试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的Ep管中，标注为对照管。
3、测定管：取 200μL 酶液，加入500μL试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的Ep管中，标注为测定管。
4、对照管和测定管同时置于50℃水浴锅中反应30min。
5、加入 800μL试剂二，沸水浴5min ，自来水冷却后取200μL于微量石英比色皿/96 孔板中测定540nm处吸光值，分别记为A对照管和A测定管，△A= A测定管- A对照管。
酶活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.2805x - 0.0255 ，R2 = 0.9991
(1) 按照蛋白浓度计算
酶活性定义：
在 50℃, pH4.6 条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 0.891×(△A+0.0255)÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
酶活性定义：
在 50℃, pH4.6 条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/g鲜重)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 0.891×(△A+0.0255)÷ W
(3) 按液体体积计算
酶活性定义：
在 50℃, pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反总÷V样÷T= 0.891×(△A+0.0255）
(4) 按细胞数量计算
酶活性定义：
在 50℃, pH4.6 条件下，每 10⁴个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/10⁴cell)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反总÷(V样×细胞数量(万个)÷V样总)÷T= 0.891×(△A+0.0255)÷细胞数量（万个）V反
总：反应总体积，1.5mL ，V 样：反应体系中加入样本体积，0.2mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg
mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.1403x - 0.0255 ，R2 = 0.9991
(1) 按照蛋白浓度计算
酶活性定义：
在 50℃, pH4.6 条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反总÷(V 样×Cpr)÷T=1.782×(△A+0.0255)÷Cp
(2) 按照样本质量计算
酶活性定义：
在50℃, pH4.6 条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/g)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反总÷(W×V 样÷V样总)÷T= 1.782×(△A+0.0255)÷ W
(3) 按液体体积计算
酶活性定义：
在50℃, pH4.6 条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反总÷V样÷T= 1.782×(△A+0.0255)
(4) 按细胞数量计算
酶活性定义：
在 50℃, pH4.6 条件下，每10⁴个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/10⁴cell)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反总÷(V样×细胞数量(万个)÷V样总)÷T= 1.782×(△A+0.0255)÷ 细胞数量(万个)V反
总：反应总体积，1.5mL，V 样：反应体系中加入样本体积，0.2mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，
mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。
注意事项：
1、用干净的镊子取出滤纸条，带手套卷成卷放入 Ep 管底部。
2、样本灭活时保证同一批样本处理时间一致，建议沸水浴十分钟。
3、批量样本测定之前先做1-2个样本的预实验，若吸光值超过 1.2，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数
4、显色后取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条，以免带入毛状物，影响测定结果。
