糖化酶(Glucoamylase)检测试剂盒 ; 100T/48S
测定意义：
糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称 γ-淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性末端水解 α-1,4 糖苷键和 α-1,6 糖苷键，将淀粉完全水解为葡萄糖，因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。
测定原理：
糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物，在 540nm 处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比，可测定计算得糖化酶的活力。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1瓶，4℃保存。（若出现沉淀，可以90℃加热5分钟溶解后使用）试剂二：液体 10mL ×1瓶，4℃避光保存。
酶液提取：
1、组织：按照质量(g)：提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约0.1g，加入1mL提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃, 10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：蒸馏水体积（mL）为 500~1000:1 的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 4℃ , 10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3、培养液或其它液体：直接检测。
测定操作：
| 对照管 | 测定管 |
样本(μL） | | 10 |
灭活样本(μL） | 10 | 50 |
试剂一 (μL） | 100 | 100 |
充分混匀，40℃反应 20min |
试剂二(μL） | 90 | 90 |
混匀，沸水浴 5min，自来水冷却后，于微量石英比色皿/96 孔板，蒸馏水调零，测定 540nm 处吸光值 A，△A=A 测定管-A 对照管 |
酶活性计算公式：
标准曲线：y = 0.2164x - 0.0182 ，R²= 0.9992
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按照蛋白含量计算
酶活性定义：
在 40℃, pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/mg prot)=(△A+0.0182)÷0.2164×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 2.54×(△A+0.0182)÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
酶活性定义：
在40℃, pH4.6 条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶(U/g)=(△A+0.0182)÷0.2164×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=2.54×(△A+0.0182)÷W
(3) 按照液体体积计算
酶活性定义：
在40℃, pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/mL)=(△A+0.0182)÷0.2164×V反总÷V样÷T= 2.54×(△A+0.0182）
(4) 按照细胞数量计算
酶活性定义：
在40℃, pH4.6条件下，每10⁴个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/10⁴cell)= (△A+0.0182)÷0.2164×V反总÷(V样×细胞数量(万个)÷V 样总)÷T= 2.54×(△A+0.0182)÷细胞数量(万个)V
反总：反应总体积，0.11mL ，V 样：反应体系中加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓
度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，20min。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.1082x - 0.0182 ，R² = 0.9992
1、按照蛋白含量计算：
酶活性定义：
在40℃, pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/mg prot)=(△A+0.0182)÷0.1082×V反总÷（V样×Cpr)÷T = 5.08 × (△A+0.0182)÷ Cpr
2、按照样本质量计算：
酶活性定义：
在40℃, pH4.6条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/g)=(△A+0.0182)÷0.1082×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=5.08×(△A+0.0182)÷W
3、按照液体体积计算：
酶活性定义：
在40℃, pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/mL)=(△A+0.0182)÷0.1082×V反总÷V样÷T=5.08×(△A+0.0182）
4、按照细胞数量计算：
酶活性定义：
在40℃, pH4.6条件下，每 10⁴个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性(U/10⁴cell)=(△A+0.0182)÷0.1082×V反总÷(V样×细胞数量（万个)÷V 样总)÷T= 5.08×(△A+0.0182)÷细胞数量(万个)
V 反总：反应总体积，0.11mL ，V 样：反应体系中加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积,1mL；Cpr：样本蛋白浓
度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，20min
注意事项：
1、灭活样本的制备建议将样本放在沸水浴中煮沸 10min，以将酶彻底灭活。
2、测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
