α-L阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)检测试剂盒 ; 50管/24样

α-L阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)检测试剂盒 ; 50管/24样

测定意义： 

α-L-Af 是一种能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残基的糖苷酶类，使细胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不断解离，促进果胶的增溶和降解。由于果实成熟过程中常常伴随着阿拉伯糖的丧失，该酶活性在果实成熟软化中的研究具有重大意义。

测定原理： 

α-L-Af 分解对硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 α-L-Af 活性。

自备实验用品及仪器：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体 15mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体 50mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~100

0 ：1的比例（建议 500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W ，超声 3s ，间隔10s，

重复30次）；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

α-L-Af 活性计算：

标准条件下测定的回归方程为y=0.00585x -0.0027；x为标准品浓度(nmol/mL)，y为吸光值。

(1) 按样本蛋白浓度计算

      单位的定义:

      每mg组织蛋白每 min 产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

      α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=39.89×(ΔA+0.0027)÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

      单位的定义：

      每 g 组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

      α-L-Af 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反总]÷(W×V样÷V 样总)÷T=39.89×(ΔA+0.0027)÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

      单位的定义：

      每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

      α-L-Af 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反总]÷(500×V样÷V 样总)÷T=0.08×(ΔA +0.0027)Cpr：样本蛋白

      质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.5mL；V 样：加入反应体系中样本体积,0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL

      W：样本质量，g； 500 ：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。