β-半乳糖苷酶(β-GAL)检测试剂盒 ; 50管/24样
测定意义：
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。
测定原理：
β-GAL 分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 β-GAL 活性。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体 15mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体 50mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~100
0 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、培养液等液体样本：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：
试剂名称(μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 200 | |
蒸馏水 | | 200 |
试剂二 | 250 | 250 |
样本 | 50 | 50 |
迅速混匀，放入 37℃准确水浴30min |
试剂三 | 1000 | 1000 |
充分混匀，400nm 处测定吸光值 A ，计算 ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。 |
β-GAL 活性计算：
标准条件下测定的回归方程为y=0.00543x -0.0027；x为标准品浓度(nmol/mL)，y为吸光值。
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:
每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=61.39×(ΔA+0.0027)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=61.39×(ΔA+0.0027)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(500×V样÷V 样总)÷T=0.123×(ΔA +0.0027)
(4) 按液体体积计算
单位的定义：
每mL液体样本每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL 活力(nmol/min /mL)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷V 样÷T=61.39×(ΔA+0.0027)V 反总：反应体系总体积，0.5mL
V 样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积,0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质
浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500 ：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间30min。
