α-半乳糖苷酶(α-GAL)检测试剂盒 ; 50管/24样

α-半乳糖苷酶(α-GAL)检测试剂盒 ; 50管/24样

测定意义： 

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化 α 半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL 对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的 D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

测定原理： 

α-GAL 分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 α-GAL 活性。

自备实验用品及仪器：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体 15mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体 50mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积(mL)500~1000 ：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

α-GAL活性计算：

标准条件下测定的回归方程为y=0.00543x -0.0027；x为标准品浓度(nmol/mL)，y为吸光值。

(1) 按样本蛋白浓度计算

      单位的定义:

      每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

      α-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=61.39×(ΔA+0.0027)÷Cpr需要另外测定，建

      议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

(2) 按样本鲜重计算

      单位的定义：

      每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

      α-GAL活力(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=61.39×(ΔA+0.0027)÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

      单位的定义：

      每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

      α-GAL活力(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(500×V样÷V 样总)÷T=0.123×(ΔA +0.0027)V 反总：反应体

      系总体积，0.5mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积,1mL；Cpr：样本蛋白质浓度mg/mL；

      W：样本质量，g； 500 ：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间30min。