Ca++Mg++ ——ATP酶检测试剂盒 ; 100管/48样
测定意义：
Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成 ADP 和无机磷。
测定原理：
根据 Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入6mL蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：液体 2mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水，4℃保存；
试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
试剂六：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后 4℃保存一周；
试剂七：液体 25mL×1瓶，室温保存；
试剂八：10mmol/L标准磷贮备液10mL×1瓶，4℃保存；
0.5μmol/mL标准磷应用液配制：将试剂八20倍稀释，即取 0.1mL 试剂八加1.9mL蒸馏水充分混匀。定磷剂的配制：按 H₂O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注 意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为500~1000 ：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
2、血清(浆)样品：直接检测。
操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
| 对照管 | 测定管 |
试剂一 (μL） | 65 | 45 |
试剂二(μL） | 60 | 60 |
试剂三(μL） | | 20 |
样本(μL） | | 100 |
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min |
试剂四(μL） | 25 | 25 |
样本 (μL） | 100 | |
混匀，8000g ，25℃离心 10min，取上清液 |
3、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)
| 空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 |
0.5μmol/ml 标准磷应用液(μL） | | 20 | | |
上清液(μL） | | | 20 | 20 |
蒸馏水(μL） | 20 | | | |
定磷试剂(μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀，室温放置 30min，在660nm处，记录各管吸光值。 |
注 意：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管保证测48份Ca⁺⁺Mg⁺⁺-ATP 酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。
Ca⁺⁺Mg⁺⁺-ATPase 活力的计算：
1、血清（浆）Ca⁺⁺Mg⁺⁺- ATPase活力的计算：
定义：
每小时每毫升血清(浆)中 Ca⁺⁺Mg⁺⁺- ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca⁺⁺K⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h/mL)=[C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷V样÷T=7.5×(A测定管-A对管)÷(A
标准管-A空白管)
2、组织、细菌或细胞中 Ca⁺⁺Mg⁺⁺- ATPase活力的计算：
(1) 按蛋白浓度计算
定义：
每小时每毫克组织蛋白中 Ca⁺⁺Mg⁺⁺- ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca⁺⁺Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h/ mg prot)= [C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(V样×Cpr)÷T=7.5×(A测
定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
定义：
每小时每克组织中Ca⁺⁺Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca⁺⁺Mg⁺⁺ATP酶活力(μmol/h/g鲜重)= [C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(W×V样÷V样总)÷T=7.5×(A测
定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
定义：
每小时每1万个细菌或细胞中Ca⁺⁺Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca⁺⁺Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h /10⁴)= [C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(500×V样÷V总)÷T=0.015×(A
测定管-A对照管)÷(A标准管 -A 空白管)C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.25mL；V样：加入样本
体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；
500：细菌或细胞总数,500万。
