转氢酶-1检测试剂盒 ; 50管/48样
测定意义：
TH位于线粒体的内膜上，又称为呼吸电子传递链复合体六，催化NADH+NADP⁺和 NAD⁺+NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体 NADH含量增加时会导致线粒体膜的 H+电化学梯度升高，因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进 NADH转换为NADPH，从而提高线粒体的抗氧化能力。
测定原理：
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代 NADP⁺，TH-1催化 APADP⁺还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收，因此通过测定375nm光吸收增加速率，来计算TH-1活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 50mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 25mL×2瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存；
试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1（此步可选做）
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入500uL试剂二，超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声 3s，间隔10秒，重复30次），用于TH-1活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 375nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
(1) 工作液的配制：临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
(2) 在1mL玻璃比色皿中加入100μL样本和1000μL工作液，混匀，立即记录375nm处初始吸光值A1和10min后的吸光值A2 ，计算 ΔA=A2-A1。
TH-1活性计算：
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T=164×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1活性(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T=82×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1活性(nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样÷V样总×500)÷T=0.164×ΔA V反总：反应体系总体积，1.1×10-
³L；ε：APADPH 摩尔消光系数，6.7×10³L /mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取
液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
