转氢酶-2检测试剂盒 ; 100管/96样
测定意义：
TH位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP⁺和 NAD⁺+NADPH相互转化，调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH。
测定原理：
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺，TH-2催化APAD⁺还原生成APADH， APADH在375nm有特征光吸收，测定375nm 光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 50mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 18mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入500uL试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声3s，间隔10秒，重复 30次），用于TH-2活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至375nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
(1) 工作液的配制：临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
(2) 在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液，混匀，立即记录 375nm处初始吸光值A1和10min后的吸光值A2，计算 ΔA=A2-A1。
TH-2活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=74.5×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:
每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmolAPADPH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min /10⁴cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.149×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-
⁴L；ε ：APADPH 摩尔消光系数，6.7×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样:加入样本体积，0.02 mL；V样总:加入提取
液体积，0.5mL；T:反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性（nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=149×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:
每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.298×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-
⁴L；ε：APADPH摩尔消光系数，6.7×10³L / mol /cm；d：96 孔板光径，5cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提
取液体积，0.5mL；T:反应时间，10 min；Cpr:样本蛋白质浓度，mg/mL；W:样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
