线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH辅酶Q还原酶检测试剂盒 ; 25管/24样
测定意义：
复合体 Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O2还原生成 O2.- ，是呼吸电子传递链上产生 O2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。
测定原理：
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成 NAD⁺，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存；0.5 mL×1瓶，-20℃保存液体25mL×2瓶，4℃保存；
试剂四：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂五：1 mL×1支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入2mL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保
存，禁止反复冻融。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
(1) 工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
(2) 在1mL石英比色皿中加入40μL样本、800μL工作液和60μL试剂六，立即混匀，记录 340nm处初始吸光值 A1和2min后的吸光值A2 ，计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅰ活力单位的计算：
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1808×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=365×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.73×ΔA V反总：反应体系总体积，9×10-
⁴L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L /mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液
体积，0.202mL；T：反应时间，2min；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
