线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶检测试剂盒 ; 100管/48样
测定意义：
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-AT合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理：
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 100mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 80mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：2 mL×1瓶，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂五：8mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂九：液体 10mL×1瓶，室温保存。
定磷试剂的配制：按 H₂O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注 意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g，4℃离心5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g ，4℃离心10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。
5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅱ酶活性测定。
测定步骤：
1、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
试剂名称(μL） | 对照管 | 测定管 |
试剂四 | 10 | 10 |
试剂五 | 40 | 40 |
样本 | | 50 |
混匀， 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴30min |
试剂六 | 20 | 20 |
样本样本 | 50 | |
混匀，4000g ，25℃离心 10min，取上清液 |
2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂）
上清液 | 30 | 30 |
定磷试剂 | 170 | 170 |
混匀，室温静置 10min 后，在 660nm 处读取 A 测定管和 A 对照管，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管设一个对照管。 |
复合体Ⅴ活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y= 1.274x + 0.004；x为标准品浓度(mmol/L)，y为A 值
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/mgprot)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V反总×10⁶]÷(V样×Cpr)÷T=62.8×(ΔA-0.004)÷Cpr此法需要自行测定样
本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V反总×10⁶]÷(W×V样÷V 样总)÷T=50.7×(ΔA-0.004)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:
每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /10⁴cell)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V反总×10⁶]÷(500×V样 ÷V样总)÷T=0.101×(ΔA-0.004)V反总：反应体
系总体积，1.2×10-⁴L； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本
蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y =0.637x +0.004；x为标准品浓度(mmol/L)，y 为 A 值
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×10⁶]÷(V样×Cpr) ÷T=125.6×(ΔA-0.004)÷Cpr此法需要自行测
定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×10⁶]÷(W×V样÷V 样总)÷T =101.5×(ΔA-0.004)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:
每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/10⁴cell)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×10⁶]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.203× (ΔA-0.004)V 反总：反应体
系总体积，1.2×10-⁴L； V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样
本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
