线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶检测试剂盒 ; 25管/12样
测定意义：
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理：
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和 Pi ，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：1 mL×1瓶，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂五：6mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂九：液体 10mL×1瓶，室温保存。
定磷试剂的配制：按 H₂O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注 意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g，4℃离心5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ(此步可选做)。
5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声3s ，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。
测定步骤：
1、酶促反应
试剂名称(μL） | 对照管 | 测定管 |
试剂四 | 25 | 25 |
试剂五 | 100 | 100 |
样本 | | 125 |
混匀， 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴30min |
试剂六 | 50 | 50 |
样本 | 125 | |
混匀，4000g ，25℃离心 10min，取上清液 |
2、定磷
上清液 | 170 | 170 |
定磷试剂 | 830 | 830 |
混匀，室温静置 10min 左右，在 660nm 处读取 A 测定管和 A 对照管，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。 |
复合体Ⅴ活性计算：
标准条件下测定的回归方程为y =1.274x + 0.004；x为标准品浓(mmol/L)，y 为 A 值
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V反总×10⁶]÷(V样×Cpr) ÷T=62.8×(ΔA-0.004)÷Cpr此法需要自行测定
样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V反总×10⁶]÷(W×V样÷V 样总)÷T =50.7×(ΔA-0.004)÷W。
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(μmol/10⁴cell)=[(ΔA-0.004)÷1.274×V反总×10⁶]÷(500×V样÷V 样总)÷T=0.101×(ΔA-0.004)V反总：反应体系总体
积，3×10-4 L；V样：加入样本体积，0.125 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白
质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
