4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)检测试剂盒 ; 100管/96样
测定意义：
4CL是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A酯，是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
测定原理：
4CL催化 4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，在333nm下测4-香豆酸CoA生成速率，即可反映4CL活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体 25 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；
粗酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声3s，间隔10s，重
复 30次）； 8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪40℃预热30min以上，调节波长至333nm，蒸馏水调零。
2、准备96孔UV板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于340nm务必使用UV板）。
3、样本测定
(1) 在试剂二中加入10mL试剂一充分溶解混匀，置于40℃水浴预热10min；现配现用（配好后24h内用完）；
(2) 在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL样本和190μL试剂二，混匀，立即记录 333nm处初始吸光值A1和40℃反应30min 后的吸光值A2，计算 ΔA=A2-A1。
4CL活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟生成1nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=31.75×ΔA÷Cpr。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=31.75×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.063×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-⁴L；ε:
4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数，2.1×10 ⁴L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提
取液体积，1 mL；T：反应时间，30min； Cpr:样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：
每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=63.49×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义：
每g组织每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=63.49×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：
每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.127×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-⁴L；ε:
4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取
液体积，1 mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
