类黄酮糖基转移酶(UFGT)检测试剂盒 ; 50管/48样
测定意义：
类黄酮是植物次生代谢产物，糖基化是类黄酮基本结构形成的最主要的修饰反应之一，提高了类黄酮苷元的化学稳定性，这一过程主要由类黄酮糖基转移酶催化的，使类黄酮-OH与UDPG反应，是黄酮合成途径中的关键酶。
测定原理：
类黄酮糖基转移酶催化花青素与尿苷二磷酸葡萄糖反应产生花青苷，主要以矢车菊素3-葡萄糖苷（C3G）形式存在，用HPLC检测产物可反映类黄酮糖基转移酶的酶活性。
需自备的仪器和用品：
天平、研砵、离心机、恒温水浴锅、100 目筛、高校液相色谱、针头过滤器(水系、0.22μm)、滤膜(水系、0.45μm)、耐水C18柱(4.6×250mm)、样品瓶、甲酸、甲醇(色谱级)、超纯水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加全部试剂三溶解；
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体8mL×1瓶，4℃保存；
标准品：标准品×1支，-20℃保存。
样本处理：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：2~5的比例（建议称取约0.5g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
实验前的准备工作：
1、检测产物制备
| 对照管 | 测定管 |
样本(μL） | 100 | 100 |
试剂一(μL） | 100 | |
试剂二 (μL） | | 150 |
充分混匀，30℃反应 30min |
试剂一 (μL） | 150 | |
试剂二(μL） | | 100 |
充分混匀，10000g ，4℃, 离心 10min ，取上清过 0.45 μm 水系滤头，待检测。 |
2、将500 mL超纯水和500 mL甲醇用0.45μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤）
3、流动相的配制：流动相A为1.6%甲酸水溶液； 流动相B为1.6%甲酸甲醇溶液。
4、将配好的流动相超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。
5、标准品的配制：在标准品中加入1mL甲醇，配成5μmol/mL母液，将母液用甲醇分别稀释成2μmol/mL，1μmol/mL、 0.5μmol/mL、0.25μmol/mL、0.125μmol/mL的标准品溶液。针头式过滤器过滤后待测。
测定操作步骤：
1、开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μL，梯度洗脱为0~5min， 85%A+15%B; 5~10min，85%A+15%B; 10~30min，80% A+20%B; 30~30.1min，60%A+40%B; 30.1~40min，0%A+100%B 。流速 1mL/min，柱温30℃, 走样时间为50min，检测波长530nm，设置完毕保存方法组。
2、初始设置流动相 A=85%，流动相 B=15%，流速1 mL/min，待基线稳定后开始加样。
3、加入标准品10μL，在50min内可分离C3G，C3G的保留时间在25min左右，（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的C3G标准品的峰面积。
4、加入样品10μL，在相应保留时间处检测C3G的峰面积。
酶活计算：
1、以标准品浓度(μmol/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标计算C3G标准曲线。将样品峰面积代入标准曲线，计算样品C3G含量
2、酶活单位定义：
A：每毫克组织蛋白每分钟催化反应产生 1μmolC3G 定义为一个酶活单位。
UFGT 活性(μmol/min/mg prot)= C×V反总÷(V样×Cpr)÷T=0.117×C÷Cpr
B：每克组织每分钟催化反应产生1μmolC3G定义为一个酶活单位。
UFGT活性(μmol/min/g鲜重)= C×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T =0.117×C÷W C： C3G浓度，μmol/mL ；V 反总：反应总体
积，0.35mL；V 样：加入样本量，0.1mL ，V 样总：加入提取液体积，1mL ，Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g ，
T：反应时间，min。
注意事项：
1、流速由小到大调节，避免柱压过大。
2、使用完毕时，先用 50%的甲醇水溶液洗色谱柱45min ，再用纯甲醇冲洗色谱柱 30min。
3、标准品的稀释倍数要根据样品中 C3G 浓度确定，样品中 C3G 的峰面积必须落在不同浓度的 C3G 标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。
