源桔生物大鼠三碘甲状腺原氨酸(T3)ELISA检测试剂盒竞争法检测原理

T3属于小分子半抗原，无法使用双抗体夹心法，只能采用竞争ELISA；试剂盒检测总T3(TT3)，仅供科研使用。

一、检测原理(固相直接竞争法)

微孔板预包被抗大鼠T3特异性抗体。同时加入：待测样本/系列T3标准品+HRP标记T3(酶标抗原)样本内天然T3与酶标记T3，竞争性争夺固相抗体有限结合位点：样本T3浓度越高→结合到板上的HRP-T3越少→显色越浅，OD值越低样本T3浓度越低→结合HRP-T3越多→颜色越深，OD值越高OD值与T3浓度呈负相关洗板去除所有未结合游离抗原；加入TMB底物显色，硫酸终止，450nm读取OD；采用四参数Logistic(4PL)拟合标准曲线计算样本浓度。次要亚型：生物素竞争体系包被抗T3抗体→样本T3+生物素标记T3竞争结合；洗涤后再加HRP-亲和素，后续显色逻辑一致。

二、试剂盒常规组分

预包被抗T3抗体微孔板T3标准品(冻干粉/原液，梯度复配)HRP-T3酶结合物/生物素-T3样本稀释液20×浓缩洗涤液(PBS+Tween-20)TMB显色液(A、B液或单组分)终止液(2MH₂SO₄)。

三、样本采集与保存

1)血清(首选)大鼠腹主动脉/眶静脉采血，室温静置2h/4℃过夜；1000×g，20min离心，吸取上清。

2)血浆推荐EDTA抗凝；慎用肝素，高浓度肝素会干扰抗原抗体结合。采血30min内离心分离血浆。

3)组织匀浆预冷PBS制备10%组织匀浆，充分裂解后10000×g离心取上清。

保存条件

短期：2–8℃≤24h

长期：-20℃/-80℃分装冻存；严禁反复冻融

溶血、脂血样本尽量舍弃，易造成结果偏移

四、标准通用操作流程(直接竞争HRP标记方案)

所有试剂提前平衡至室温20–25℃；建议样本、标准品做复孔；

洗涤液配制：20×浓缩洗涤液用蒸馏水1:20稀释；结晶37℃水浴溶解后再稀释；

加样标准孔/样本孔：50μL标准品/待测样本除空白孔外，每孔加入50μLHRP-T3酶结合物；轻轻震荡混匀，封膜。

竞争孵育：37℃，60min

洗板：弃液，洗板4–5次，每次浸泡10–30s；最后一次拍干孔内残液(孔底不能残留洗液)

显色：每孔加入TMB底物液90–100μL；避光，37℃孵育10–20min(观察标准孔出现清晰蓝色梯度即可终止)

终止：每孔加入50μL终止液，溶液由蓝变黄，轻柔混匀

读数：5min内酶标仪检测，主波长450nm，参比620/630nm扣除背景

五、典型性能参数(国产试剂盒通用区间)

检测范围：0.25~8ng/mL(不同厂商略有差异)

最低检测限(灵敏度)：＜0.15ng/mL

板内变异CV＜8%；板间CV＜10%

特异性：与T4、rT3、TSH无明显交叉反应

六、关键注意事项(竞争法特有坑点)

曲线是负相关！不要误用直线拟合禁止使用线性回归，必须软件4PL拟合；很多新手直接线性拟合导致浓度完全错误。竞争反应对孵育时间、温度极其敏感，不要随意缩短/延长孵育。洗板不充分→背景偏高、标准曲线梯度消失；孔干燥会破坏固相抗体，严禁干孔。高浓度样本超出标准曲线上限，必须用试剂盒配套样本稀释液梯度稀释重测，最后乘以稀释倍数。

T3在血液中大量与TBG(甲状腺结合球蛋白)结合；本试剂盒为总T3检测，如需游离FT3，需要配套解离试剂预处理样本。底物避光保存，显色液变蓝失效，不可使用。

源桔生物是一家集科研、生产、销售为一体的生物高新技术企业，以科研试剂生产、诊断试剂原料供应为核心，致力于为全球来自高等院校、政府研究机构、诊断试剂生产厂家以及生物公司的广大客户们提供高质量生物产品。